石仙桃多糖对肺炎支原体感染模型小鼠Th1/Th2细胞因子表达的影响

黄梅青 朱燕华 赵世元

[摘要] 目的 探討石仙桃多糖对肺炎支原体肺炎模型小鼠的肺泡灌洗液（BALF）中γ-干扰素（IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素（IL）-1β、IL-12等细胞因子表达的影响。 方法 采用配对设计随机方法将90只BABL/C裸鼠分为三组：模型组、克拉霉素组和石仙桃多糖组，每组30只。用PPLO肉汤培养基培养肺炎支原体，将成功培养的肺炎支原体滴入裸鼠鼻腔1×107 CCU/mL菌液各50 μL（1、5、8 d）。造模第9天开始，石仙桃多糖组用石仙桃多糖干预，克拉霉素组按15 mg/kg剂量灌胃给药，连续6 d，模型组灌胃等体积的生理盐水。干预1、3、6 d后，分别收集小鼠BALF，用SP4琼脂平板定量培养BALF肺炎支原体，采用酶联免疫吸附测定（ELISA）法测定小鼠BALF中IL-1β、IL-12、IFN-γ、TNF-α等细胞因子水平，肺部组织用中性甲醛固定HE染色，观察肺炎支原体感染小鼠肺的病变程度。 结果 与模型组比较，石仙桃多糖组BALF定量培养肺炎支原体菌落数量明显减少（P < 0.05），肺部炎症明显好转，肺组织病理学评分和肺实质炎症评分明显下降（P < 0.05或P < 0.01）。治疗第1、3、6天，石仙桃多糖组IL-1β、IL-12、IFN-γ、TNF-α水平较模型组明显降低，差异均有统计学意义（P < 0.05）。 结论 石仙桃多糖显著减轻肺炎支原体肺炎小鼠肺部炎症，其机制可能与降低肺炎支原体肺炎模型小鼠体内Th1/Th2细胞因子IL-1β、IL-12、IFN-γ和TNF-α的表达有关。

[关键词] 石仙桃；多糖；肺炎支原体；细胞因子；Th1/Th2

[中图分类号] R766.4 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）03（b）-0015-05

Effect of polysaccharide of Pholidota chinensis Lindl. on the expression of Th1/Th2 cytokines in mice infected with Mycoplasma pneumoniae

HUANG Meiqing1 ZHU Yanhua2 ZHAO Shiyuan2

1.Department of Pediatrics， Chongzuo People's Hospital， Guangxi Zhuang Autonomous Region， Chongzuo 532200， China； 2.Department of Pharmacy， the Affiliated National Hospital of Guangxi Medical University， Guangxi Zhuang Autonomous Region， Nanning 530001， China

[Abstract] Objective To investigate the effects of polysaccharide of Pholidota chinensis Lindl. on the expression of γ- interferon （IFN-γ）， tumor necrosis factor-α （TNF-α）， interleukin （IL）-1β， IL-12 and other cytokines in bronchoalveolar lavage fluid （BALF） of model mice of Mycoplasma pneumoniae pneumonia. Methods By matched pair design random method， ninety BALB/c nude mice were randomly divided into three groups： model group， Clarithromycin group and polysaccharide of Pholidota chinensis Lindl. group， with 30 mice in each group. PPLO broth medium was used to cultivate mycoplasma pneumonia， the successfully cultivated Mycoplasma pneumoniae was dropped into the nasal cavity of nude mice 1×107 CCU/mL bacteria solution， each 50 μL （1， 5， 8 d）. From the ninth day of modeling， polysaccharide of Pholidota chinensis Lindl. group was started to be use polysaccharide of Pholidota chinensis Lindl.， Clarithromycin group was given 15 mg/kg of Clarithromycin by intragastric administration， continued for 6 d， the model group was given same volume of normal saline by gavage. After intervention for 1， 3， 6 d， the mice BALF was collected， SP4 agar plate was used to cultivate BALF Mycoplasma pneumoniae quantificationally， enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA） was used to detect the levels of IL-1β， IL-12， IFN-γ， TNF-α. Lung tissue was fixed with neutral formalin to take HE staining. The pathological degree of mice infected by Mycoplasma pneumoniae was observed. Results Compared with model group， the number of bacterial colonies of Mycoplasma pneumoniae cultivated by BALF quantificationally in polysaccharide of Pholidota chinensis Lindl. group was reduced significantly （P < 0.05）， the pulmonary inflammation was improved significantly， and the scores of lung pathology and pulmonary parenchyma were decreased significantly （P < 0.05 or P < 0.01）. After treatment for 1， 3， 6 d， the levels of IL-1β， IL-12， IFN-γ， TNF-α in polysaccharide of Pholidota chinensis Lindl. group were significantly lower than those of model group， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Conclusion Polysaccharide of Pholidota chinensis Lindl. can significantly reduce the pulmonary inflammation of mice with Mycoplasma pneumoniae pneumonia， the mechanism may be related to reduce the expression of Th1/Th2 cytokines of IL-1β， IL-12， IFN-γ， TNF-α in model mice with Mycoplasma pneumoniae pneumonia.

[Key words] Pholidota chinensis Lindl.； Polysaccharide； Mycoplasma pneumoniae； Cytokine； Th1/Th2石仙桃来源于兰科石仙桃属植物石仙桃Pholidota chinensis Lindl.的假鳞茎或全草，广泛分布于福建、广东、广西等省，其水提物具有养阴、清肺、利湿、消瘀的功效，民间用来治疗眩晕、头痛、咳嗽、吐血、梦遗、痢疾等[1]。石仙桃主要成分是多糖[2]，其药理作用研究较少。本研究采用石仙桃提取的石仙桃多糖通过建立肺炎支原体肺炎模型BALB/c小鼠，观察肺炎支原体菌落数量、肺组织病理学评分、肺实质炎症评分和肺泡灌洗液（BALF）中γ-干扰素（IFN-γ）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素（IL）-1β、IL-12等的表达，探讨石仙桃多糖治疗肺炎支原体肺炎小鼠可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

90只BALB/c小鼠，SPF级，北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物合格证编号：SCXK（京）2016-009。BALB/c小鼠5周龄，（20±2）g，雌雄各半，大鼠饲养条件：室温20～25℃，用干燥锯末垫底，室内通风良好，光线良好充足。大鼠在广西中医药大学动物实验中心饲养。

1.2 实验用药

石仙桃鳞径采自广西区境内，经广西中医药大学药用植物教研室刘寿养教授鉴定为兰科石仙桃属植物石仙桃，石仙桃鳞茎洗净后切细，干燥后打粉。石仙桃粉加1∶40蒸馏水80℃回流5 h，待冷却后用无水乙醇沉淀，沉淀物用丙酮和乙醚萃取数次，得粗多糖。粗多糖用Sevag法脱除蛋白质，用95%乙醇沉淀，再将沉淀物水解、醇沉，用丙酮和乙醚脱水，重复操作数次，得石仙桃多糖[2]。经高效色谱，有一对称单峰，并在260～280 nm无吸收峰，说明多糖含量较高。样品真空包装、冰箱冷藏保存在广西医科大学附属民族医院中心实验室。

1.3 主要仪器和试剂

UV紫外可见分光光度计（美国安捷伦公司，型号：1100型）；红外光谱仪（德国Bruker公司，型号：IR EQUINOX 55）；超导核磁共振谱仪（英国VG公司，型号：ESCALABMK-11型）；熔点测定仪（北京科仪电光仪器厂，型号XPR-201）；离心机（常州市凯航仪器有限公司，型号：YXJ-2）；酶标仪（上海科华生产，型号：MK3）。

柱层析用硅胶（100～200目）、薄层层析硅胶（200～300目）均由青岛海洋化工生产（批号：14089、141020）。PPLO肉汤培养基购于青岛海博生物技术有限公司，肺炎支原体菌液购于上海宝米科生物科技有限公司。克拉霉素分散片（江西制药有限责任公司生产，批号：20150319）。细胞因子试剂盒IL-1β（批号：20160608）、IL-12（批号：20160628）、IFN-γ（批号：20160518）、TNF-α（批号：20160512）购于BioSource International，Camarillo，CA。

1.4 实验方法

1.4.1 肺炎支原体的培养 肺炎支原体培养在每瓶20 mL的SP4肉汤中，经37℃、5%CO2培养72 h后，肉汤变成橙色，倒出上清液，加新鲜的SP4肉汤2 mL，收集贴壁存活肺炎支原体。将肺炎支原体配成108～109 CFU/mL，加制霉菌素（50 U/mL）和氨苄青霉素（1 mg/mL），样本保存在-80℃备用。

1.4.2 动物模型的建立 实验方案由广西医科大学实验动物伦理委员会审查，所有的动物按照实验动物的护理和使用指南处理。新购BALB/c小鼠适应新环境3 d。采用配对设计随机方法将90只BALB/c小鼠分为模型组、克拉霉素组和石仙桃多糖组，每组30只。各组小鼠第1天滴鼻接种含1×107 CCU/mL肺炎支原体菌液50 μL（将小鼠头后仰滴加菌液，使菌液流入呼吸道），第5、8天接种含1×107 CCU/mL肺炎支原体菌液各100 μL。造模成功标准：造摸第9天小鼠血液分离培养和PCR检测肺炎支原体，确认肺炎支原體模型的建立[3]。石仙桃多糖组小鼠于第9天起首次灌胃石仙桃多糖30 mg/kg（0.2 g溶于5%葡萄糖注射液0.1 mL，即0.05 mL/g），以后每天按15 mg/kg灌胃，连续6 d。克拉霉素组造摸第9天起按15 mg/kg克拉霉素剂量灌胃给药，连续6 d。模型组同期灌胃给予等体积生理盐水。用药期间每天观察各组小鼠表现，如小鼠存活、进食、饮水、活动度、精神状态差，有无竖毛寒战、咳嗽，口鼻分泌物有无增多。在用药1、3、6 d后，各组分别取10只小鼠，用乙酰丙嗪氯胺酮按5 mg/kg腹腔注射麻醉小鼠后，用25号针头将500 μL SP4肉汤注入肺部，随后又将该液抽吸到注射器，BALF分3管，第1管做肺炎支原体培养，第2管做细胞计数，第3管离心吸上清并储存在-80℃；肺标本用10%福尔马林溶液固定进行组织学评价。

1.5 观察指标

1.5.1 BAL肺炎支原体培养 将BAL用SP4肉汤稀释10倍稀释，接种在SP4琼脂平板，置37℃培养48 h。通过计数琼脂板上的菌落数量推算BAL标本细菌数量（用log10 CFU/mL表示）。

1.5.2 肺组织病理学评分和肺实质炎症评分 肺组织经10%福尔马林固定，石蜡包埋切片，经苏木精-伊红染色。肺组织病理学评分由专业病理医师双盲镜检。肺组织病理学评分分级基于细支气管支气管浸润数目、细支气管支气管管腔渗出程度、血管周围浸润百分率和实质性肺炎严重程度（中性粒细胞肺泡浸润），该系统评分分值为0～26分，分数越高代表肺组织炎性浸润程度越高。肺实质炎症评分是基于分级的中性粒细胞肺泡浸润（0分，没有实质性肺炎；3分，片状实质性肺炎；5分，片状融合实质性肺炎）[4]。

1.5.3 各组小鼠BALF中Th1/Th2细胞因子的检测 采用酶联免疫吸附测定（ELISA）法检测BALF中IL-1β、IL-12、IFN-γ、TNF-α等细胞因子的水平，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1.6 统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件进行数据处理，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t法。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 石仙桃多糖对肺炎支原体肺炎小鼠BALF肺炎支原体培养结果的影响

各组小鼠BALF定量培养肺炎支原体，结果显示，与模型组比较，石仙桃多糖组及克拉霉素组小鼠治疗1、3、6 d后，BAL标本细菌数量均呈现逐渐减少的趋势，但差异无统计学意义（P > 0.05）。见图1。

2.2 石仙桃多糖对肺炎支原体肺炎小鼠肺组织病理和肺实质炎症的影响

治疗3 d后，与模型组比较，石仙桃多糖组及克拉霉素组肺组织病理学评分和肺实质炎症评分均明显降低，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。治疗6 d后，模型组小鼠肺组织出现重度炎症改变：肺泡出现大量的渗出物，肺泡间质增宽，在支气管和血管周围以及肺泡间质有大量淋巴细胞和巨噬细胞浸润；克拉霉素组炎症细胞明显减少；石仙桃多糖组小鼠肺组织中炎症细胞也明显减少，可见肺泡间质稍增宽，在支气管、血管周围有少量淋巴细胞和巨噬细胞。见图2～4。

2.3 石仙桃多糖不同干预时间对肺炎支原体肺炎小鼠BALF中Th1/Th2细胞因子表达的影响

治疗第1天，石仙桃多糖组肺炎支原体肺炎小鼠BALF中IL-1β、IFN-γ水平明显下调，与模型组比较差异有统计学意义（P < 0.05）。治疗第3天，石仙桃多糖组肺炎支原体肺炎小鼠BALF中IL-1β、IL-12、IFN-γ水平明显下调，与模型组比较差异有统计学意义（P < 0.05）。治疗第6天，石仙桃多糖组肺炎支原体肺炎小鼠BALF中IL-1β、IL-12、TNF-α水平明显下调，与模型组比较差异有统计学意义（P < 0.05）。见表1。

3 讨论

石仙桃属是兰科植物，别名石橄榄、石上仙桃和石上莲等。石仙桃性甘、淡、凉，具有清热润燥、化疾止咳、滋阴解毒、凉血止痛等功效，民间用于肺热咳嗽、肺结核咳血、淋巴结结核、小儿疳积、胃十二指肠溃疡、慢性骨髓炎等。用石仙桃的鲜品或干品煎汤内服，可治肺结核咳血、慢性咳嗽、胃肠炎、慢性胃炎、小便不利、湿热浮肿、咽喉肿痛[5-6]。石仙桃的主要成分是多糖，含量高达2.25%[7]。研究表明，多糖具有多方面的生物活性，如抗病毒、抗炎、抗肿瘤、抗凝血、降糖等作用[8]。但迄今为止，有关石仙桃多糖的药理作用研究国内外均鲜见报道。本研究采用广西柳州柳江区石仙桃提取的石仙桃多糖，通过建立肺炎支原体肺炎模型BALB/c小鼠，探讨石仙桃多糖治疗肺炎支原体肺炎小鼠可能的作用机制。

本研究采用石仙桃多糖干预肺炎支原体肺炎模型小鼠，定量培养小鼠BALF肺炎支原体，结果发现，肺炎支原体有减少的趋势，但与模型组比较没有显著差异（P > 0.05），石仙桃多糖对肺炎支原体肺炎定量微生物培养结果的影响与石仙桃多糖改善肺部炎症不相关，其可能通过抑制微生物蛋白合成，影响体内肺炎支原体复制频率，从而改变宿主免疫系统的激活。

研究发现肺炎支原体肺炎在发病免疫学中起重要作用，其中T细胞既有免疫保护又有免疫致病的双重作用[9-11]。机体在抵抗病原体、预防肺炎支原体肺炎肺外并发症、加速机体恢复中依赖T细胞的激活。研究发现，SCID小鼠和普通小鼠感染相同数量的肺炎支原体，普通小鼠肺部炎症明显加重，而SCID小鼠由于免疫T或B细胞，其肺部炎症较轻，淋巴细胞在肺炎支原体肺炎肺部症状中起重要作用[12-15]。肺炎支原体肺炎的细胞免疫调节使Th1表达上调，造成了呼吸系统的免疫损伤[16-18]。根据细胞因子分为Th1和Th2两大功能细胞亚群，Th1细胞分泌IFN-γ、IL-2、TNF-β、IL-12细胞因子，主要参与细胞免疫反应，在机体清除病原微生物的过程中起重要作用。Th2细胞主要分泌IL-1β、IL-4、IL-5、IL-10、IL-13等细胞因子，主要参与体液免疫调节。人体健康情况下，Th1/Th2处于平衡状态。若Th1/Th2失衡，可以使免疫功能发生紊乱，在其他诱因的协同下可致免疫性疾病[19]。

肺炎支原体肺炎机体Th1/Th2值下降，Th2细胞占优势，机体存在免疫失调[20]。本研究通过观察肺炎支原体肺炎小鼠BALF不同时间细胞因子的表达，结果显示，治疗第1天，石仙桃多糖组肺炎支原体肺炎小鼠BALF中IL-1β、IFN-γ水平明显下调，治疗第3天，石仙桃多糖组肺炎支原体肺炎小鼠BALF中IL-1β、IL-12、IFN-γ水平明显下调。IL-12在Th1型细胞因子中较为重要，它能调节Th1/Th2平衡，IL-12表达下调时，Th1反应低下，而Th2反应增强[13]；同时IL-12對Th2型细胞因子的产生具有抑制作用，可抑制Th2型应答反应，减轻气道炎性反应。呼吸系统的免疫损伤迅速减轻。

综上所述，石仙桃多糖干预肺炎支原体模型小鼠能迅速调节肺炎支原体肺炎小鼠体内的免疫功能，小鼠BALF中IL-1β、IFN-γ、IL-12、TNF-α等细胞因子明显下调，辅助性Th1细胞因子明显降低，小鼠肺部炎症明显减少，其作用机制可能与调节肺炎支原体模型小鼠体内Th1/Th2细胞有关。本研究结果为石仙桃多糖研发成为抗支原体药物提供理论依据。

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（收稿日期：2017-11-25 本文編辑：张瑜杰）