异氟烷预处理对缺氧/复氧引起的心肌细胞损伤的影响

付海钰 秦福恩 徐帅 杨淋 钟祖凌 巩固

[摘要] 目的 探讨异氟烷（Iso）在缺氧/复氧（A/R）诱导的心肌细胞损伤中的影响及其作用机制。 方法 培养心肌细胞H9c2，用不同浓度的Iso（1%、2%、3%）预处理后进行3 h的缺氧和3 h的复氧。MTT检测细胞生长，筛选Iso使用浓度，随后实时定量PCR检测miR-499表达。在3% Iso预处理的A/R损伤心肌细胞中转染miR-499的过表达试剂miR-499 mimic，流式细胞术检测细胞凋亡；Western blot检测Caspase-3、Caspase-9、Bax和Bcl-2的蛋白表达；试剂盒检测细胞中乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶（CK）和谷氨酸氨基转移酶（ALT）的含量。 结果 与Control组比较，A/R组的细胞活力显著下降（P < 0.05），同时Iso预处理剂量依赖性的诱导细胞活力增加，由而筛选出3%作为Iso预处理浓度。与Control组比较，miR-499的表达在A/R组中显著提升（P < 0.05），并在3% Iso预处理心肌细胞（Iso组）中下降（P < 0.05）。与Control组比较，A/R组的细胞生长显著降低（P < 0.05），细胞凋亡升高（P < 0.05），促凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-9、Bax表达升高（P < 0.05），抑凋亡蛋白Bcl-2表达降低（P < 0.05），LDH、CK和ALT的含量明显升高（P < 0.05）。Iso预处理抑制以上由A/R诱导的H9c2细胞损伤，并且此心肌细胞保护作用可被miR-499过表达反转。 结论 Iso可以通过抑制miR-499表达减轻A/R引起的心肌细胞损伤。

[关键词] 异氟烷；miR-499；心肌细胞；缺氧/复氧

[中图分类号] R972 [文獻标识码] A [文章编号] 1673-7210（2018）03（b）-0009-06

Effect of Isoflurane on anoxia/reoxygenation-induced cardiocyte injury

FU Haiyu QIN Fuen XU Shuai YANG Lin ZHONG Zuling GONG Gu

Department of Anesthesiology， General Hospital of Chengdu Military Region of PLA， Sichuan Province， Chengdu 610083， China

[Abstract] Objective To investigate the effect of Isoflurane （Iso） on anoxia/reoxygenation （A/R）-induced cardiocyte injury and underlying mechanism. Methods Cultured cardiocytes （H9c2） were pre-treated with Iso （1%， 2%， 3%） and then stimulated with 3 h of anoxia and 3 h of reoxygenation. Cell proliferation was measured by MTT method， and the Iso concentration was selected. The miR-499 overexpression reagent， miR-499 mimic was transfected into cardiocytes pre-treated with 3% Iso and simulated with anoxia/reoxygenation. Cell apoptosis was detected by flow cytometry assay. The expression level of caspase-3， caspase-9， Bax and Bcl-2 were measured by Western blot. The contents of lactic dehydrogenase （LDH）， creatine kinase （CK） and alanine aminotransferase （ALT） were detected by corresponding kit， respectively. Results Compared with the control group， cell proliferation was significantly decreased in A/R group （P < 0.05）， and increased dose-dependently in Iso pre-treated cells （P < 0.05）， thus 3% was selected to be the concentration of Iso pre-treatment. Compared with the control group， the expression of miR-499 was significantly increased in A/R group （P < 0.05）， and decreased in 3% Iso treated cells （P < 0.05）. Compared with the control group， cell proliferation was significantly decreased （P < 0.05）； cell apoptosis was increased （P < 0.05）； the expression of pro-apoptotic protein caspase-3， caspase-9 and Bax were increased （P < 0.05）， anti-apoptotic protein Bcl-2 was decreased （P < 0.05）； the content of LDH， CK and AST were increased in A/R group （P < 0.05）. Iso pre-treat inhibited A/R induced H9c2 injury， and the protective effect of Iso was reversed by miR-499 overexpression in damaged cardiocyte. Conclusion Isoflurane attenuates anoxia/reoxygenation-induced cardiocyte injury through inhibiting miR-499 expression.

[Key words] Isoflurane； miR-499； Cardiocyte； Anoxia/reoxygenation

目前，心脑血管疾病已成为我国仅次于恶性肿瘤的第二杀手[1-2]。心肌细胞损伤是参与多种心血管疾病发生发展的重要机制之一[3-4]。心肌缺血/再灌注损伤（I/RI）一直是心血管疾病的研究热点问题[5]。心肌的持续性缺血会导致心肌细胞的死亡以及组织损伤，早期的再灌注可以减轻心肌缺血所引起的心肌损伤，但在大量的临床以及动物实验观察中发现，血流的再灌注在改善心肌供血的同时会加重心肌缺血所造成的损伤，引起心律失常、心室收缩功能降低以及心肌梗死等[6]。病理变化上缺血/再灌注可能引起心肌细胞水肿、细胞器膜以及细胞膜完整性的破坏、心肌纤维断裂、微血管损伤等[7]。因此I/RI是影响心血管疾病患者心脏结构和功能恢复的主要因素之一。缺氧/复氧（anoxia/reoxygenation，A/R）诱导的心肌损伤模型常用来在细胞水平上模拟I/RI[8]。在心血管疾病的临床治疗中，有成千上万的患者需要在术中接受全身麻醉。在体内和体外的研究表明，多种麻醉剂可以通过抵抗A/R抑制心肌的损伤[9]。异氟烷是临床上常用的挥发性麻醉剂之一。已有研究报道，异氟烷预处理可以保护心脑血管术后损伤，然而其保护作用的具体机制尚未研究清楚[10]。MicroRNA（miRNA）参与到心肌缺血与再灌注引起的心血管损伤中多个环节的调控，影响并沉默多个相关信号通路中关键蛋白的表达[11]。最近有研究表明，在接受挥发性麻醉剂七氟烷麻醉的心血管病患中，miR-499的表達较低，表明miR-499可能参与麻醉剂预处理对心肌损伤的保护作用[12]。本研究以A/R诱导的心肌细胞为研究对象，探讨异氟烷对心肌细胞损伤的保护作用及其与miR-499的关系。

1 材料与方法

1.1 心肌细胞A/R模型的建立

心肌细胞H9c2购于美国模式培养物保藏所（American type culture collection，ATCC），培养于混合10%胎牛血清的高糖DMEM培养液（HyClone公司）中，并置于37℃、5%CO2培养箱中培养，细胞生长至90%融合状态后传达，取对数期生长状况良好的细胞进行随后实验。心肌细胞的A/R模型通过以下方法来构建：弃去原有培养液后，H9c2细胞中加入预充95%N2+5%CO2的缺氧液，并置于含有95%N2+5%CO2的密闭容器中培养3 h，再将缺氧的细胞换用预充95%O2+5%CO2的含糖复氧液，并置于含有95%N2+5%CO2的密闭容器中培养3 h。

1.2 细胞分组

异氟烷筛选实验分为五组：Control组为正常培养的H9c2细胞；A/R组细胞经过3 h缺氧和3 h复氧处理；异氟烷处理组（以下简称“Iso组”）细胞分别经过1%、2%和3%浓度异氟烷（Baxter公司，批号：088008）预处理30 min后，进行3 h缺氧和3 h复氧处理。细胞转染实验用LipofectamineTM-3000，按试剂盒说明进行。异氟烷+miR-499 inhibitor组在加入3%异氟烷预处理的同时转染20 μmol/L miR-499 inhibitor（上海吉凯基因），再进行A/R处理；异氟烷+inhibitor control组在加入3%异氟烷预处理的同时转染20 μmol/L inhibitor control，再进行A/R处理。

1.3 MTT法检测细胞活力

细胞分组处理后用MTT法检测其细胞活力。各组H9c2细胞以6×104个/孔，接种于96孔板，并且每组细胞设置3个复孔，继续培养24 h。弃去原培养液后每孔加入MTT（5 g/L）20 μL，置于37℃培养4 h。弃去上清，每孔加入150 μL二甲基亚砜（DMSO），振荡10 min使结晶充分溶解，使用酶标仪上检测各组细胞吸光度值A490，并计算细胞活力，细胞活力=处理组A490/Control组A490×100%。

1.4 实时定量PCR法检测miR-499表达变化。

采用常规的Trizol法提取心肌细胞的总RNA，反转录后用SYBR Green进行qRT-PCR。反应体系为：SYBR Green Mix 9 μL；反转录产物2 μL；Forward primer 2 μL；Reverse primier 2 μL；加水至总体积20 μL。反应参数为：95℃ 20 s；95℃ 10 s，60℃ 20 s，72℃ 10 s，35个循环；72℃延伸1 min。以U6 snRNA为内参照，实验结果miR-499和U6产物倍数按2-ΔΔCt计算。

1.5 流式细胞术检测心肌细胞凋亡

AV/PI双染凋亡检测试剂盒购自BD公司。心肌细胞分组处理后，用4℃预冷的PBS洗涤2次，随后加入含0.02% EDTA的0.25%胰酶消化并且收集细胞。加入1×annexin Ⅴ结合缓冲液1 mL，800 r/min离心8 min后弃去上清，加入结合缓冲液200 μL重悬细胞。并在悬液中加入5 mg/L的annexin V-FITC 10 μL以及PI 5 μL，混匀后37℃避光孵育30 min。最后以激发波长488 nm，发射波长530 nm，流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.6 Western blot法检测蛋白水平

心肌细胞分组处理后，加入RIPA细胞蛋白裂解液65 μL，提取细胞总蛋白，用BCA法测定蛋白浓度。总蛋白经SDS-PAGE电泳分离，电泳后转膜；5%脱脂奶粉室温封闭1 h后，分别加入1∶1000稀释的山羊抗鼠Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9、和GAPDH的Ⅰ抗，4℃环境轻摇过夜。过夜后加入1∶100比例稀释的HRP-标记的兔抗山羊Ⅱ抗（Pierce公司），室温下孵育1 h，漂洗3次；最后结果用X线胶片曝光分析，Image-Pro Plus软件处理，以待测蛋白与内参GAPDH的灰度值比值作为蛋白的相对表达量。

1.7 生化指标测定

细胞分组培养后取培养液上清，按各自检测试剂盒操作说明步骤，测定乳酸脱氢酶（LDH）、肌酸激酶（CK）和谷氨酸氨基转移酶（ALT）的含量（南京建成生物工程研究所）。

1.8 统计学方法

采用统计学软件SPSS 13.0分析，所有数据以均数±标准差（x±s）表示，实验数据用单因素方差分析进行统计学分析，组间两两比较采用Bonferroni法进行，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 异氟烷预处理提升A/R的心肌细胞活力

用不同浓度的异氟烷（1%、2%、3%）预处理心肌细胞后，进行A/R实验，MTT法检测异氟烷对细胞活力的影响。如图1所示，与Control组比较，A/R组的细胞活力显著降低（P < 0.05）。在加入异氟烷预处理的细胞中，细胞活力上升，并且异氟烷能够剂量依赖性地诱导细胞活力的增加（P < 0.05）。因此，在后续实验中选取3%作为异氟烷的处理浓度。

2.2 3%异氟烷抑制A/R心肌细胞中miR-499表达

实时定量PCR检测结果显示，A/R组的miR-499表达水平是Control组的（5.6±0.8）倍（P < 0.05），这表明A/R上调心肌细胞中miR-499的表达。加入3%异氟烷预处理后，miR-499的表达与A/R组相比明显降低（P < 0.05），表明异氟烷对A/R引起的心肌细胞损伤的保护作用可能与miR-499有关。见图2。

2.3 过表达miR-499降低3%异氟烷处理的A/R心肌细胞活力

如图3A所示，实时定量PCR检测结果表明，与3% Iso组比较，加入miR-499 mimic转染的心肌细胞中miR-499的表达显著增高（P < 0.05），表明miR-499 mimic成功转染到细胞中。MTT检测心肌细胞活力，结果如图3B所示，与Iso组比较，Iso+miR-499 mimic组的细胞活力明显降低（P < 0.05）。

2.4 抑制miR-499提升异氟烷处理的A/R心肌细胞凋亡

流式细胞仪检测细胞凋亡，结果如图4所示，与Control组比较，A/R组的细胞凋亡明显升高；并且与A/R组比较，3%异氟烷处理的细胞凋亡显著降低（P < 0.05）。与Iso组比较，Iso+miR-499 mimic组的细胞凋亡明显升高（P < 0.05）。Western blot法检测促凋亡蛋白Caspase-3、Caspase-9、Bax以及抑凋亡蛋白Bcl-2的表达，结果显示Caspase-3、Caspase-9、Bax在A/R組中比Control组显著增加，Iso组中下降，并在加入miR-499 mimic转染后明显提升。与之相反，Bcl-2在A/R组中比Control组降低，异氟烷中上升，在Iso+miR-499 mimic组中比异氟烷中显著下降（P < 0.05）。

2.5 抑制miR-499降低异氟烷处理的A/R心肌细胞中LDH、CK、AST的含量

测量心肌细胞损伤的指标LDH、CK、AST在细胞上清液中的含量。LDH的测量结果表明，与Control组[（563±53）U/L]比较，A/R组[1033±89）U/L]中的LDH含量显著上升，并在3%异氟烷处理后[Iso组，（662±49）U/L]下降（P < 0.05）；并且与Iso组比较，Iso+miR-499 mimic组中的LDH[（914±32）U/L]明显提升（P < 0.05）。CK的测量结果显示，A/R组中的CK含量[（2316±184）U/L]比Control组[（1335±130）U/L]中显著提升，Iso组中的CK含量[（15616±140）U/L]比A/R组中明显降低，异氟烷+miR-499 mimic组的CK含量[（1967±106）U/L]比Iso组中提升（P < 0.05）。AST的测量结果表明，与Control组[（25±5）U/L]比较，ALT在A/R组[（48±6）U/L]中显著上升，并在3%异氟烷处理后[Iso组，（29±4）U/L]下降；同时与Iso组比较，Iso+miR-499 mimic组中的ALT[（36±5）U/L]明显提升（P < 0.05）。见图5。

3 讨论

随着细胞生物学的发展，从细胞水平上研究心肌的功能已成为心血管研究的重要方向之一[13]。已有研究表明，临床用麻醉剂，如七氟醚、喷妥钠、异丙酚能抑制术后心机功能的损伤[14-15]。异氟烷作为常用的全身麻醉剂之一，能够抵抗A/R诱导的心肌细胞损伤，但其具体调控机制还未见报道[16]。Liu等[12]研究表明，miR-499可能参与到麻醉剂七氟烷对心血管疾病术后的保护作用。为此，本研究以A/R诱导的心肌细胞为损伤模型，观察异氟烷和miR-499对损伤的心肌细胞损伤作用，以期为以后心血管疾病麻醉剂的使用提供新的理论依据。

在心肌细胞缺氧的时候，能量代谢过程受到阻碍，心肌细胞的细胞膜受到损伤[17]。复氧后，随着大量氧气的涌入，产生大量的氧自由基，诱导细胞膜的脂质过氧化，使生物膜受到损伤，造成细胞内钙的超载，并使细胞膜的通透性增加，从而导致细胞受损[18]。为了探讨异氟烷保护心肌细胞损伤的机制，本研究用H9c2细胞进行A/R处理。梁冰等[16]的研究中选用2%浓度作为异氟烷的处理浓度，本研究中分别用1%、2%、3%浓度的异氟烷预处理心肌细胞随后进行A/R处理，观察不同浓度的异氟烷对心肌细胞生长的影响以进行浓度筛选，结果显示异氟烷可以显著抑制A/R引起的心肌细胞活力下降，并且其作用具有浓度依赖性，提示异氟烷可以减轻A/R诱导的心肌细胞损伤，与Yan等[13]的研究结果一致。心肌细胞的生长随着异氟烷浓度的增加而提升，但是在浓度增加的过程中，增长幅度变低，在3%异氟烷处理组中，心肌细胞的生长已较高，推测在更高浓度的异氟烷处理组中细胞生长会继续增加，但增幅较小。因此本研究选用3%作为后续实验中异氟烷的处理浓度。同时本研究检测出在受损的心肌细胞中miR-499的表达显著上升，并且在加入异氟烷预处理后下降，与miR-499在麻醉剂七氟烷中的结果一致[12]。MiR-499过表达抑制了异氟烷对受损的心肌细胞活力的提升，以上结果提示，miR-499可能参与异氟烷对受损心肌细胞的保护作用。

细胞凋亡又称程序性死亡，是严格受到调控的细胞自主死亡形式[19]。细胞的凋亡过程是心肌细胞受到损伤病变后的重要表现之一[20]。在A/R的过程中，缺氧是心肌细胞凋亡的诱导者，而随后的复氧会加速细胞的凋亡[21]。本研究结果显示异氟烷可以减轻A/R的心肌细胞凋亡，与其他研究者的报道一致。Caspase-3和Caspase-9是細胞凋亡过程中关键的蛋白酶，在多种凋亡途径的下游充当效应蛋白，是重要的凋亡执行者[22]。促凋亡分子Bax以及抗凋亡蛋白Bcl-2分属于Bcl蛋白家族。研究表明，Bcl-2过表达对多种因素诱导的细胞凋亡有抑制作用，同时Bax通过调节Bcl-2的活性而起到促凋亡作用[23]。本研究检测了细胞凋亡相关蛋白，异氟烷能够抑制Caspase-3、Caspase-9和Bax的表达，并提升抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，进一步说明异氟烷可以抵制A/R诱导的心肌细胞凋亡。同时，miR-499过表达可以减缓异氟烷对心肌细胞凋亡的抑制作用，说明异氟烷可以通过调节miR-499减轻A/R诱导的心肌细胞凋亡。

为了进一步说明异氟烷对受损心肌细胞的作用，本研究检测了细胞上清液中LDH、CK和ALT的含量。LDH、CK和AST为心肌细胞的细胞内酶，其漏出量的多少可以反映细胞膜的受损严重程度[24-25]。本研究结果显示，异氟烷减轻了A/R诱导的细胞中LDH、CK和AST的含量，提示异氟烷对受损的心肌细胞具有保护作用，同时此作用可被miR-499过表达所拮抗。

综上所述，本研究结果提示异氟烷可以抑制A/R诱导的心肌细胞生长降低、细胞凋亡及受损，而miR-499的过表达可以拮抗其保护作用，为心脑血管疾病患者的临床麻醉提供理论研究基础。

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（收稿日期：2018-01-03 本文编辑：张瑜杰）