2016年新疆尉犁县羊蓝舌病的诊断

丁梦玥 ，马晓菁 ，叶 锋 ，刘 帅 ，薛新梅 ，宋迎春 ，加帕尔·哈斯木 ，易新萍 ，刘丽娅，孟肖潇，马俊杰 ，谷文喜*，钟 旗*

（1.新疆农业大学动物医学学院，新疆 乌鲁木齐 830052；2.新疆畜牧科学院兽医研究所，新疆 乌鲁木齐 830000；3.新疆尉犁县畜牧兽医工作站，新疆 尉犁县 841500；4.新疆巴音郭楞蒙古自治州动物疾病控制与诊断中心，新疆 库尔勒 841000）

蓝舌病（bluetongue，BT）是一种由呼肠孤病毒科环状病毒属的蓝舌病病毒（BTV）引起的急性病毒性传染病，是一种经由吸血昆虫库蠓、伊蚊等媒介昆虫叮咬传播的、严重侵害反刍动物的非接触性虫媒病[1]。世界动物卫生组织（OIE）规定蓝舌病为A类传染病，我国规定为一类传染病。蓝舌病不仅可以通过昆虫传播，还可以通过精液和胎盘屏障垂直传播。该病主要侵害绵羊，表现为体温升高、口鼻腔黏膜水肿及舌发绀，有明显的临床症状，死亡率为5%～35%，亦可感染山羊、牛、鹿及其他野生反刍动物，但多呈隐性感染，临床症状不明显[2-3]。

该病18世纪首次出现于南非好望角，随后陆续蔓延至其他地区，至今除南极洲外，其他各大洲皆有蓝舌病的流行，主要的疫区主要集中在欧洲、中东和北非这3大疫区[4]。目前发现蓝舌病共有27种血清型(BTV-1～BTV-27)，型与型之间缺乏有效的交叉保护作用，不同血清型的流行情况与地域有着紧密联系。我国已发现7种血清型，其中BTV-1型和BTV-16型为我国的主要致病血清型[5]。

新疆于1989年首次在全疆范围内进行了蓝舌病的流行病学调查，不同物种的总阳性率为2.64%[6]，2012年再次对新疆8个地（州）进行了流行病学调查，其中尉犁县羊的阳性率最高为3.33%[7]，这说明新疆是广泛存在蓝舌病的，而且有感染率逐年增长的趋势。本研究是在新疆尉犁县建立一个蓝舌病血清学检测为阴性的哨兵动物群，分别于2016年和2017年的7月-11月每周采血1次，进行BTV血清抗体检测，监控哨兵动物群蓝舌病感染情况。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

BTV抗体检测试剂盒（c-ELISA）和抗原检测试剂盒（Ac-ELISA）由云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室提供。TransZol Up总RNA提取试剂盒和EasyScriptROne-Step RT-PCR SuperMix试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司。

1.2 哨兵动物群的建立及样品的采集

对新疆尉犁县某养殖场的羊进行BTV血清学抗体检测，选取检测结果为阴性的10只山羊和10只绵羊组成哨兵动物群。于2016年7月-11月每周采样1次，共采集血清和肝素钠抗凝血各303份。血清-20℃保存，抗凝血4℃保存。

1.3 引物合成

BTVVP7基因的引物序列由云南省热带亚热带动物病毒病重点实验室提供，引物序列:BTV-VP7 F:5'-GTTAAAAATCTATAGAGATG-3’/BTV-VP7 R:5’-GTAAGTGTAATCTAAGAGA-3’。

1.4 BTV血清学抗体检测

按照BTV c-ELISA试剂盒说明书，取出4℃保存的ELISA板条，设阴、阳性对照、空白对照（PBST）各2孔，按2孔/样加入待测血清，先后加入竞争性抗体和酶标二抗，孵育，洗板，加入TMB显色液避光显色10～15 min，加入终止液，用酶标仪在OD450 nm处读值，依照说明书上的公式，计算血清样品的抑制率。

1.5 病毒的分离

选取转阳样品、转阳前一周样品及转阳后一周样品的肝素钠抗凝血，加入1 mL PBS，洗涤5次，1000 r/min离心10 min，弃上清。再加入1 mL 1%双抗的高纯水，涡旋破碎红细胞，孵育30 min，5000 r/min离心10 min，取上清接种于培养好的BHK-21细胞上，37℃5%CO2培养箱中培养，盲传5代。对于出现CPE的孔，则吸取细胞液进行后续研究，盲传5代后未出现CPE的弃去。

1.6 病变细胞液中BTV抗原的检测

按照BTV Ac-ELISA试剂盒说明书，用试剂盒中的山羊抗BTV包被抗体包被ELISA板，洗涤，设阴、阳性对照、空白对照（PBST）各2孔，按2孔/样加入待测血清，放入温箱37℃孵育1 h 30 min。洗板，依次加入兔抗BTV血清竞争液，绵羊抗兔酶标二抗，孵育，洗板，拍干。加入TMB显色液，避光显色10 min。加入终止液。用酶标仪在OD450 nm处读值。

1.7 病变细胞液BTV VP7基因片段的RT-PCR扩增

用TransZol Up总RNA提取试剂盒提取病毒总RNA，用One-Step RT-PCR试剂盒，以变性后的总RNA为模板，以BTV-VP7 F和BTV-VP7 R为引物，扩增BTV VP7基因片段。

反应程序:45 ℃ 30 min；94 ℃ 2 min；（94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min 30 s）×40；72 ℃ 10 min；4℃保存。

2 结果

2.1 监控群BTV血清学抗体检测

2016年共采集羊血清303份，共检测出2份阳性血清，阳性率为0.66%。这2份阳性血清都为10月采集。

2.2 病毒的分离

在接种BHK-21细胞盲传三代后，有14份样品出现CPE，表现为细胞变圆、团聚、脱落，形成空斑，多数细胞死亡（图1），表明接种的样品中存在病毒粒子，致使BHK-21细胞出现CPE。

图1 接种分离株后BHK-21细胞病变

2.3 病变细胞液中BTV抗原的检测

对出现CPE的14份细胞液进行BTV抗原捕获ELISA检测，14份细胞液均为BTV阳性，表明确实存在BTV粒子。

2.4 病变细胞液BTV VP7基因片段RT-PCR扩增结果

琼脂糖凝胶电泳分析BTV VP7基因的RT-PCR扩增产物，在1156 bp处均有一条清晰目的条带，与预期结果相一致（图2）。表明扩增BTV VP7的基因片段，而引起CPE出现的病毒为BTV。

图2 病变样品BTV VP7基因片段RT-PCR扩增结果

3 讨 论

我国于1979年首次在云南省师宗县检测出绵羊蓝舌，之后相继在安徽省（1985年）、四川省（1989年）、湖北省（1983年）等29个省均检出BTV血清阳性畜。从1979年起直至1991年前，蓝舌病的爆发区域还主要集中在长江以南，1991年和1993山西省报道了蓝舌病的感染情况[8，9]，由此可以看出从1979年我国首次发现蓝舌病开始，该病已经渐渐跨越过长江，向北传播至华北地区和西北地区。新疆于1988-1989年首次采用琼脂糖凝胶扩散实验方法对蓝舌病进行了普查，共普查17个地（州）86个县（市），平均阳性率为2.53%，其中山羊阳性率较高为17.04%，绵羊阳性率为1.77%[9]。新疆畜牧科学院兽医研究所于2012年再次对新疆8个地州的8个县市进行蓝舌病调查，羊血清BTV检出率为1.32%，其中尉犁县阳性率最高为 3.33%[7]，证明蓝舌病在新疆长期存在，且广泛流行。 尉犁县位于 N40°10′33″～41°39′17″，处于蓝舌病流行的纬度带上，从本研究对哨兵动物群BTV抗体变化的结果来看，仅10月出现2份阳性样品，这可能与当地气候有关。

由于BTV的存活时间在血清中较长而在动物体内较短，通常是动物感染BTV转阳前、后1～2周可以分离到病毒，超过2周就无法分离到病毒。本研究在监测哨兵动物群的BTV转阳情况的同时，对转阳前、后1～2周的样品进行了病毒的分离，成功分类到了14株羊源蓝舌病毒，14株病毒除1株为从绵羊分离到的外，剩下的都为山羊身上分离到的毒株，说明分离到的蓝舌病毒可能对山羊有较强的感染性，后续还需对分离到的蓝舌病毒进行进一步的分型研究和鉴定。

本研究通过设置哨兵动物群，监测抗体变化并进行细胞分毒，最后成功分离到14株羊源性BTV，所分离到的蓝舌病毒毒株还需进行进一步的鉴定及测序，进一步的分析血清型是否与已发现的血清型一致，为继续调查研究新疆BTV病原及其流行特征提供科学依据。

参考文献:

[1]林丽琴，吕敏娜，孙铭飞，等.广东某奶牛场蓝舌病病毒分离株血清型与基因型的鉴定[J].中国兽医科学,2016，（6）:615-621.

[2]殷丽霞.蓝舌病的研究现状[J].吉林畜牧兽医,2009,30(5):8-10.

[3]王荣亮,胡骑,信爱国.蓝舌病病原分子生物学及免疫学研究进展[J].中国畜牧兽医,2011,38(8):177-181.

[4]何宇乾,吴海燕,徐琼.蓝舌病的流行现状[J].中国兽医科学,2012,42(05):537-540.

[5]张胜男,常建华,韩明浩,等.蓝舌病的研究进展[J].黑龙江畜牧兽医,2015,(19):57-60.

[6]秦其英,邰振国,王力俭,等.新疆动物蓝舌病流行病学调查及病毒分离鉴定[J].云南畜牧兽医,1991(3):79-80.

[7]王玉,谷文喜,石保新,等.2012年新疆蓝舌病血清学调查及区间分布[J].中国动物检疫,2014,31(5):52-55.

[8]韩明浩.内蒙古地区2015年牛羊蓝舌病流行病学调查及病毒的初步分离鉴定[D].呼和浩特:内蒙古农业大学,2016:2.

[9]舒展，刘帅，加帕尔·哈斯木，等.新疆地区羊蓝舌病流行病学调查与分析[J].草食家畜，2017，(1):47-51.

[10]张胜男,常建华,韩明浩,等.蓝舌病的研究进展[J].黑龙江畜牧兽医,2015,(19):57-60.