小鼠Willis环右颈总动脉灌注Microfil成像研究

陈 蓦， 王 武，李永东， 李明华

Willis环由两侧大脑前动脉起始段、两侧颈内动脉末端、两侧大脑后动脉借前、后交通动脉连通而成，其作用是调节血液分配，维持脑营养和功能活动。Willis环是颅内动脉瘤和脑缺血好发部位，颅内动脉瘤尤其好发于Willis环动脉分叉部［1］。小鼠因体型小、便于操作、价格便宜、转基因种系多等优势常用于脑动脉瘤、脑缺血、阿尔兹海默症等［2-5］模型的Willis环建模。通过小鼠Willis环灌注成像了解其完整结构，可为小鼠脑动脉瘤和脑缺血模型提供有效的实验证据。目前Willis环灌注方法多通过小鼠心尖处（左心室）进行心脏灌注，应用不同灌注剂（混合或不混合染液），最后取脑观察Willis环。这些方法虽可观察到Willis环结构，但多不完整或充盈不良，对微小脑动脉瘤就更难以清晰显示。为解决这些问题，本实验通过小鼠右侧颈总动脉灌注对比剂Microfil显示Willis环，旨在评价其成像可行性和效果。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级C57BL/6小鼠20只（雄性，约14周龄，重约20 g）。本实验设施环境条件符合中国国家标准《实验动物环境及设施》（GB14925-2001）对屏障动物实验设施的有关标准，动物饲养管理和动物实验操作符合《上海市实验动物管理条例》等法规要求。所有小鼠经标准实验室饮食喂养。研究时间为2016年3月至2017年6月。

1.2 方法

小鼠肌内注射肝素（500 U/kg），30 min后肌内注射氯氨酮稀释液（1∶4）0.2 mL作麻醉；固定小鼠后解剖胸腔，依次自心尖灌注37℃0.9%氯化钠溶液10 mL、4%多聚甲醛溶液和2%戊二醛溶液混合液（1∶1）15 mL；显微镜下分离右侧颈总动脉，将24 g留置针从心尖插入右侧颈总动脉起始部或中段，连接注射器后30 min内匀速缓慢推注Microfil（MV-130∶稀释剂 ∶硬化剂＝4∶5∶0.45）5 mL， 灌注操作示意图见图1；灌注后小鼠4℃过夜，从面部分离颅底骨后取脑，浸入4%甲醛中2～3 d，Stemi 508型和Axiocam 506 color型体视镜（德国Carl Zeiss公司）下观察。

1.3 评价

图1 小鼠灌注操作示意图

将体视镜下观察到的Willis环定义为3种状况：①完全充盈，即所有血管包括双侧颈内动脉、大脑中动脉和大脑前动脉充盈良好、灌注清晰，立体感强；②大部分充盈，即部分血管充盈良好、灌注清晰；③充盈不良，即仅有少部分血管充盈良好。

2 结果

通过小鼠右侧颈总动脉途径Microfil灌注Willis环成像技术建立的小鼠Willis环形态结构见图2。20只实验小鼠全部灌注成功，总灌注成功率为100%。其中完全充盈11只（55%），大部分充盈4只（20%），充盈不良5只（25%）。大体观察小鼠灌注后Willis环完整，染色血管显示清晰；体视镜下观察小鼠Willis环清晰、充盈、立体。

3 讨论

图2 小鼠Willis环形态结构

相比大型动物，小型动物（如鼠科、兔等）更常用于动脉瘤和脑缺血建模试验［6］。其中鼠科动物体型小、价格便宜，且因转基因技术发展有着广泛种系，可进行复杂分子和细胞技术检测［7］，故最常用于动脉瘤和脑缺血实验研究，而小鼠Willis环灌注常作为实验环节一部分。

小鼠Willis环灌注前试验已有学者报道，但方法与本研究有所不同。Lee等［8］对小鼠皮下注射肝素再麻醉30 min后，先灌注温0.9%氯化钠溶液和2%戊二醛，再以持续100 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）压力向左心室灌注多聚甲醛固定血管，脑充盈后在55℃恒温箱过夜聚合，再浸入15%氢氧化钾溶液腐蚀，流水冲洗，浸入5%蚁酸15 min，冷冻干燥机中脱水48 h；脱水样本覆盖上离子涂层后于扫描电镜（韩国COXEM公司）下观察。此方法可观察到清晰的动脉图像，但灌注方法操作复杂，处理时间长，腐蚀剂存在一定危险性，且未经染色，观察效果欠佳。李广意等［9］在实验小鼠麻醉后，体视显微镜下向左心室灌注填充剂（过氯乙稀10 g、乙酸乙脂90 mL、邻苯二甲丁2.7 mL和红色油料适量按比例配制），再将小鼠头部分离并浸于盐酸，对颅骨进行腐蚀软化；待颅骨软化后用手术器械剥离，于体视镜下观察。此方法优点是所取Willis环完整，缺点是取脑操作复杂，需要盐酸反复腐蚀小鼠颅骨，还要再用器械修饰。Sugiyama等［10］在小鼠麻醉后左心室插管，先后注射0.9%氯化钠溶液2 mL和预先混有Mogul L碳黑50 μL的乳胶复合物0.5 mL进行灌注。

通过左心室进行心脏灌注，Willis环不易完全充盈。为解决这一问题，本实验在保留前实验优点基础上对某些步骤加以改进。首先，与之前学者研究的通过心尖-左心室-主动脉弓-头臂干-右侧颈总动脉-右侧颈内动脉-Willis环行心脏灌注途径不同，本实验经右侧颈总动脉-右侧颈内动脉-Willis环途径灌注，省去了心尖-左心室-主动脉弓-头臂干这一中间环节，使得灌注血管充盈度更好，Willis环动脉显像更加具有立体感。相比于其它研究者灌注后易于观察Willis环血管外径，本实验灌注后更易于观察Willis环血管内径，达到MRA观察效果。其次，本实验选择Microfil对比剂进行小鼠Willis环灌注。Microfil是由MV染剂、稀释剂、硬化剂按一定比例混合而成的复合物。在生理注射压力下灌注Microfil即能充满小鼠微血管，并使其不透明；Microfil具有微小收缩性，可完全填充血管，提高血管灌注连续性，保证灌注后微循环在观察时清晰生动；经Microfil灌注的组织颜色具有多样化，便于显微检查和摄片［11］。再次，小鼠经灌注后从面部分离颅底骨取脑，无需腐蚀取脑。经过改进后，操作步骤得以简化且更安全，试验用时相应缩短。

实施本实验需注意：①Microfil浓度配比。硬化剂浓度过高可能在未完全灌注前Microfil先凝固，不能完成灌注，浓度过低则长时间灌注也不凝固，导致血管充盈不充分。②0.9%氯化钠溶液和固定剂推速可相对较快。Microfil灌注速度应缓慢匀速，流量过快可能造成小血管破裂，Willis环得不到完全灌注。但应注意Microfil要在30 min内灌注完成。

本实验结论认为，通过小鼠右侧颈总动脉途径灌注Microfil显示Willis环方法简单、可行，不仅能使小鼠Willis环充盈良好，还能清晰显示其立体结构，具有MRA成像效果。

［参 考 文 献］

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［2］ Nowicki KW，Hosaka K，Walch FJ，et al.M1 macrophages are required for murine cerebral aneurysm formation［J］.J Neurointerv Surg，2018，10：93-97.

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［4］ Roher AE， Esh C， Kokjohn TA， et al.Circle of willis atherosclerosis is a risk factor for sporadic alzheimer's disease［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol， 2003， 23： 2055-2062.

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［6］ 杨 飞，姜建威，王 鹏，等.新西兰大白兔脑血管造影：脑底动脉环的解剖与变异［J］.介入放射学杂志，2013，22：216-218.

［7］ Bouzeghrane F， Naggara O， Kallmes DF， et al.In vivo experimental intracranial aneurysm models：a systematic review［J］.AJNR Am J Neuroradiol， 2010， 31： 418-423.

［8］ Lee S， Kim IK， Ahn JS， et al.Deficiency of endotheliumspecific transcription factor Sox17 induces intracranial aneurysm［J］.Circulation， 2015， 131： 995-1005.

［9］ 李广意，邹柯杰，赵 娟，等.利用灌注技术观察昆明小鼠Willis环的形态结构［J］.实验动物科学，2014，31：21-22.

［10］ Sugiyama Y， Yagita Y， Oyama N， et al.Granulocyte colonystimulating factor enhances arteriogenesis and ameliorates cerebral damage in a mouse model of ischemic stroke［J］.Stroke，2011，42：770-775.

［11］ Zhu YQ， Dai DY， Xing HX， et al.Concomitant aneurysm detection in an intracranial dolichoectasia mouse model using a MicroFil polymer perfusion technique［J］.J Neurointerv Surg，2017，9：783-786.