橙皮苷-壳寡糖复合物的制备及其理化性质分析

曹汝鸽，赵亚丽，周中凯*

（天津科技大学食品工程与生物技术学院，天津 300457）

橙皮苷又名橙皮苷、柑果苷，是由一分子橙皮素与一分子的二糖缩水结合而成，属于双氢黄酮类化合物，广泛存在于柑橘类和中草药（如陈皮、枳实等）中，是橙皮中最主要的类黄酮化合物[1-4]，具有抗氧化、预防癌症、降低血管脆性和人体胆固醇含量等功效，是治疗心血管疾病的重要药物原料[5-6]。但由于橙皮苷难溶于水，使得它在功能性食品以及制药等领域的应用受到限制[7]。壳寡糖是一种来源丰富的天然高分子，是天然糖类中唯一带正电的碱性氨基多糖，具有抗氧化、抑菌、预防糖尿病、抗肿瘤等多种生物活性作用[8-11]。

多酚和多糖可以发生非共价或共价的相互作用，且多糖可以促进多酚的抗氧化能力[12]。王丽颖等[13]通过对多糖与多酚相互作用机制研究得出，多糖能够增强多酚的抗氧化、降血糖、预防心血管疾病、抗凝血等生物活性，并影响多酚生物利用率，改善食品品质。张曼等[14]对多糖和多酚形成的络合物进行研究得出，多糖和多酚形成的络合物对食品品质有影响，能够改善食品风味以及营养价值，抑制氧化和褐变等。白海娜等[15]对多酚类化合物与黑木耳多糖的复配物进行研究得出，多酚类化合物与黑木耳多糖具有协同抗氧化的作用。

目前利用壳寡糖改善橙皮苷溶解性的研究鲜见报道。为探索利用天然多糖改变天然多酚，探索两者之间的相互作用，促进天然产物在各个领域的利用率，将壳寡糖作为一种增加多酚溶解性的载体，采用喷雾干燥法将橙皮苷与壳寡糖结合，制取了一种新的橙皮苷-壳寡糖复合物。并利用扫描电子显微镜、红外光谱、热重、核磁共振等技术研究该复合物的理化性质。从分子结构层面研究橙皮苷和壳寡糖分子之间的相互作用机理，从而探索壳寡糖对橙皮苷溶解性的改善机理，并对橙皮苷-壳寡糖复合物的抗氧化活性进行评价。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

橙皮苷（分子质量610.5 Da） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；壳寡糖（分子质量980 Da） 浙江金壳药业有限公司；2,2’-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（2,2’-azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt，ABTS）、2,4,6-三吡啶基三嗪（2,4,6-tris-(2-pyridyl)-s-triazine，TPTZ）、水溶性VE（Trolox）、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 美国Sigma公司；甲酸、甲醇、无水乙醇（均为分析纯） 天津光复科技发展有限公司；重水（D2O） 上海迈瑞尔化学技术有限公司。

1.2 仪器与设备

YC-015实验型喷雾干燥机 上海雅程仪器设备有限公司；TGL-16A型高速冷冻离心机 长沙平凡仪器有限公司；XW-80微型涡流混合仪 上海沪西分析仪器有限公司；TS50傅里叶变换近红外光谱仪 美国Thermo Fisher公司；SU510扫描电子显微镜 日本日立公司；TGA-Q50热重分析仪 美国TA仪器；400 MHz核磁共振波谱仪 德国布鲁克科技有限公司；高效液相色谱仪日本安捷伦科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 橙皮苷-壳寡糖复合物的制备

用蒸馏水分别配制2 mmol/L的橙皮苷溶液和2 mmol/L的壳寡糖溶液，将两者等体积混合。将混合液在涡旋振荡器上振荡5 min，20 ℃、1 000×g离心10 min后取上清液，进行喷雾干燥（进风温度100 ℃，流速1 L/h），最终制得橙皮苷和壳寡糖物质的量比为1∶1的复合物，为复合物A。按照上述方法分别制得物质的量比为1∶5和1∶10的橙皮苷-壳寡糖复合物，分别为复合物B和C。

1.3.2 高效液相色谱分析

分别将橙皮苷及橙皮苷-壳寡糖复合物溶于超纯水中，涡旋振荡5 min后，放入37 ℃培养箱培养1 h，以10 000 r/min的转速离心10 min，取上清液，采用高效液相色谱仪测定橙皮苷含量。色谱柱：Xterra RP18柱（250 mm×4.6 mm）；流动相：溶剂A：0.1%甲酸溶液，溶剂B：甲醇溶液（含0.1%甲酸）；梯度洗脱（0～20 min，100% A～100% B），进样量为20 μL，流速为0.2 mL/min，检测波长为285 nm[7]。通过橙皮苷的峰面积与标准样品标准曲线计算橙皮苷的含量。

1.3.3 扫描电子显微镜分析

将导电胶黏于铜板上，分别取适量的纯橙皮苷、纯壳寡糖、橙皮苷-壳寡糖复合物均匀涂布在导电胶上，然后用常规真空喷镀法喷金90 s后，将铜板置于扫描电子显微镜下分别对样品进行显微拍摄。

1.3.4 傅里叶变换红外光谱分析

取适量的纯橙皮苷、纯壳寡糖、橙皮苷-壳寡糖复合物，分别用溴化钾压片后，置于傅里叶红外光谱仪中记录其红外光谱。

1.3.5 热重分析

准确称取适量的样品，放入热重分析仪中对样品进行分析，升温速率为10 ℃，测试温度范围为50～600 ℃，N2为保护气。用计算机自动记录样品的质量保留率、质量变化率曲线。其中，质量变化率曲线是热重分析的一次微分曲线。

1.3.6 核磁共振氢谱分析

分别将纯橙皮苷、橙皮苷-壳寡糖复合物A、B、C，溶于重水，采用核磁共振波谱仪分析橙皮苷及其复合物的1H核磁共振光谱。核磁共振光谱获得的单脉冲序列参数设置如下[5]：取样时间2.18 s，扫描次数16 次、延迟时间15 s，采样温度为25 ℃，其他参数为仪器内设值。

1.3.7 抗氧化活性分析

1.3.7.1 DPPH自由基清除率的测定

参考Xu Baojun[16]和Thaipong[17]等报道的方法并稍作调整。取测定液0.5 mL，加入2 mL 2×10－4mol/L DPPH溶液，再加入2.5 mL无水甲醇，充分混合，避光静置30 min，于517 nm波长处测定其吸光度A1。同时测定2 mL 2×10－4mol/L DPPH溶液与3 mL无水甲醇混合液的吸光度A2，以及0.5 mL测定液与4.5 mL无水甲醇混合液的吸光度A0。按照公式（1）计算DPPH自由基清除率：

式中：A0为样液＋无水甲醇混合液吸光度；A1为样液＋DPPH溶液＋无水甲醇吸光度；A2为DPPH溶液＋无水甲醇吸光度。

1.3.7.2 ABTS＋·清除率的测定

参考Xu Baojun[16]和Thaipong[17]等报道的方法并稍作调整。7 mmol/L的ABTS溶液与2.45 mmol/L的过硫酸钾溶液以体积比2∶1混合，在室温下置于暗处反应16 h，形成ABTS储备液。ABTS储备液使用前用无水乙醇稀释成工作液，要求30 ℃、734 nm波长下的吸光度为0.70±0.02。取样液0.2 mL，加入5 mL ABTS工作液，充分混合，室温下反应10 min，于734 nm波长处测定其吸光度A1。以无水乙醇代替样液、ABTS工作液作空白、对照。按照公式（2）计算ABTS自由基清除率：

式中：A0为样液的吸光度；A1为ABTS工作液＋样液的吸光度；A2为ABTS工作液的吸光度。

1.4 数据处理

高效液相色谱和抗氧化能力分析均做3 次平行实验。采用SPSS 19软件对抗氧化能力分析结果进行数据统计，采用ANOVA进行Duncan差异分析，P小于0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 高效液相色谱分析结果

图1 橙皮苷及橙皮苷-壳寡糖复合物水溶性对比图Fig. 1 Water solubility of hesperidin and Hesp-COS

通过研究证明，高效液相色谱法测定橙皮苷的含量具有重复性及稳定性好，实验简单安全，是橙皮苷含量检测的有效方法[18]。以高效液相色谱图中橙皮苷的峰面积为1，橙皮苷-壳寡糖复合物的峰面积相对于橙皮苷峰面积值为相对峰面积。由图1可知，将壳寡糖加入橙皮苷中大大增加了橙皮苷在水中的溶解度（物质的量比1∶1、1∶5、1∶10复合物中橙皮苷溶解度分别是纯橙皮苷的1.6、2.7、3.8 倍），并且随着壳寡糖比例的增大，橙皮苷的溶解度也变大。橙皮苷溶解度增大的一个主要原因是由于壳寡糖打乱橙皮苷原有的结晶，使其自身结晶度降低[19]，说明橙皮苷和壳寡糖发生了相互作用，壳寡糖可以显著增加橙皮苷在水中的溶解性。

2.2 扫描电子显微镜分析结果

图2 橙皮苷、壳寡糖及橙皮苷-壳寡糖复合物的扫描电子显微镜图Fig. 2 Scanning electron micrographs of hesperidin, chitosan and Hesp-COS complex

由图2可以发现，橙皮苷颗粒呈现针状结晶凝集而成的球状结构，壳寡糖颗粒呈实心的球状结构，而橙皮苷-壳寡糖复合物均呈明显的片状结构，其形态与橙皮苷、壳寡糖的电子显微镜外观相比发生明显变化。说明在喷雾干燥过程中，橙皮苷-壳寡糖相互结合形成新的物质。

2.3 红外光谱扫描分析结果

图3 橙皮苷、橙皮苷-壳寡糖复合物的红外光谱图Fig. 3 FTIR spectra of hesperidin and Hesp-COS complex

由图3可知，与橙皮苷相比，橙皮苷-壳寡糖复合物在3 423.7 cm－1位置出现的—OH特征吸收峰有所增强，在2 935 cm－1位置出现的C—H的特征吸收峰有所增强；复合物在1 276.82、1 205 cm－1位置出现的芳香醚基（＝C—O—C）的特征吸收峰有所减弱；1 095、1 069 cm－1位置的甲氧基吸收峰有所增强。橙皮苷的红外图谱具有酚羟基（3 478 cm－1）、苯环（1 445、1 520、1 470、1 607 cm－1）、芳香醚基（1 276.82、1 205 cm－1）、羰基（1 649 cm－1）的特征吸收峰[20]，而在复合物中这些特征峰消失不见。橙皮苷-壳寡糖复合物的红外光谱发生明显变化，而不同比例的橙皮苷-壳寡糖复合物之间红外光谱并没有太大的变化。橙皮苷的红外光谱吸收峰强度发生变化甚至消失，与芳香醚基的拉伸与变形有关[21]，说明橙皮苷和壳寡糖发生了分子间的相互作用，生成新的复合物，使得复合物具有与橙皮苷不同的红外吸收峰谱[22-23]。

2.4 核磁共振氢谱分析结果

用核磁共振氢谱技术分析橙皮苷-壳寡糖复合物[7]见图4，复合物中橙皮苷产生的化学位移变化值Δδ为纯橙皮苷质子的化学位移减去复合物中橙皮苷的化学位移。由表1可知，随着复合物中壳寡糖物质的量比的增加，橙皮苷中质子H2’，5’，6’（δ 0.018～0.033）；H6，H8（δ 0.007～0.044）和H2（δ 0.010～0.041）的化学位移变化值Δδ也在增大，这是由于橙皮苷和壳寡糖分子之间相互靠近，从而改变了橙皮苷质子在磁场中的环境而引起的。从Δδ值可推断，橙皮苷中H6、H8所在的A环、H2所在的C环比H2’，5’，6’所在的B环更加接近壳寡糖分子。在复合物的核磁共振氢谱中并没有观察到橙皮苷其他质子发生明显的化学位移变化，这说明橙皮苷糖基部分和壳寡糖分子之间没有相互靠近关系。多酚和多糖的相互作用是由于氢键和羟基之间的相互作用，由核磁共振结果分析可知，橙皮苷-壳寡糖复合物的稳定性主要靠橙皮苷芳香环上的羟基（—OH）和壳寡糖的羟基（—OH）来进行维系[24-25]。

图4 橙皮苷、橙皮苷-壳寡糖复合物的核磁共振氢谱Fig. 4 1H-NMR spectra of hesperidin and Hesp-COS complex

表1 橙皮苷质子在橙皮苷-壳寡糖复合物中化学位移变化值（Δδ）Table 1 Chemical shift changes (Δδ) of protons in Hesp-COS complex

2.5 热重分析结果

图5 橙皮苷、橙皮苷-壳寡糖复合物的热重分析曲线Fig. 5 Thermogravimetric analysis of hesperidin and Hesp-COS complex

图6 橙皮苷、橙皮苷-壳寡糖复合物的质量变化率曲线Fig. 6 Different thermal gravity curves of hesperidin and Hesp-COS complex

从图5可以看出，纯橙皮苷在266～500 ℃范围内质量损失61.10%，这是由于橙皮苷受热分解。而橙皮苷-壳寡糖复合物在266～500 ℃的质量损失是由于橙皮苷与壳寡糖形成的复合物发生热分解，裂解为橙皮苷和壳寡糖。在橙皮苷-壳寡糖复合物的质量变化率曲线（图6）的峰值167 ℃处，复合物A、B、C质量损失率（图5）分别为6.7%、13.11%、13.59%。即随着复合物中壳寡糖比例的增加，在该温度下复合物的热稳定性下降，这是由于橙皮苷和壳寡糖分子间的氢键作用力受热稳定性下降所造成的，由复合物裂解出来橙皮苷或壳寡糖分子进一步分解造成该温度下复合物的质量损失加大，进一步证明橙皮苷和壳寡糖之间存在非共价键作用，形成了复合物[8,22]。

2.6 抗氧化分析结果

表2 橙皮苷、壳寡糖及橙皮苷-壳寡糖复合物的抗氧化能力Table 2 Free radical scavenging capacity of hesperidin,chitooligosaccharide and Hesp-COS complex

由表2所示，橙皮苷-壳寡糖复合物对DPPH自由基清除率（86.02%～94.38%）与橙皮苷对DPPH自由基清除率（83.72%）相比有所增加，复合物对ABTS＋·清除率（12.81%～17.37%）与橙皮苷（9.15%）对ABTS＋·清除率显著提高，并随着壳寡糖比例的增加，复合物对自由基清除能力有所提高。有研究表明，黄酮类化合物的抗氧化能力与其结构有直接关系[26-27]，橙皮苷的抗氧化能力高，并且与其他在A和C环中提供儿茶酚样结构的5-OH和4-keto的类黄酮相当[28]；酚羟基基团可以增强或减弱抗氧化剂对自由基的反应活性，氢键对抗氧化剂清除自由基能力的强弱取决于从反应物到中间过渡态时氢键带来的稳定性的强弱[29]。说明橙皮苷-壳寡糖复合物中橙皮苷的结合位点A、C环发生的结构变化使得复合物抗氧化能力有所提高。并且，复合物的抗氧化能力相比壳寡糖要弱，从另一方面也说明复合物的抗氧化能力的提高可能是由于复合物中新引入的壳寡糖中亲水羟基基团的缘故[30]。

3 结 论

橙皮苷来源广泛，是天然的抗氧化剂，在功能性食品及医药领域具有广泛的应用前景。因此，改善橙皮苷的水溶性对增加其生物利用率和扩展其应用具有重大的研究意义。本实验采用喷雾干燥的方法制备橙皮苷-壳寡糖复合物，并采用扫描电子显微镜、红外光谱、热重等分析技术对该复合物的理化性质进行研究。结果表明橙皮苷与壳寡糖通过氢键或范德华力的非共价键作用形成了稳定的复合物。经高效液相色谱法分析可知，复合物使得橙皮苷在水中的溶解度得到显著提高，并且复合物对自由基的清除作用大大增强。这为橙皮苷在功能性食品，医药和化妆品等领域的创新性应用提供了新的思路。

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