PI3K/AKT信号通路与骨肉瘤组织中脂肪酸合成酶过表达的相关性

仇海军 赵 醒

(承德县中医院外二科，河北 承德 067400)

骨肉瘤与许多肉瘤组织一样，容易发生血道转移，对骨肉瘤相关发病机制的研究仍是现代医学研究的热点。蛋白激酶B(AKT)〔1～3〕本质是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，AKT蛋白质生物结构含480个氨基酸，PH 结构域位于N端，调节活性区位于C端，催化活性区位于中间，是磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/AKT信号通路的重要信号分子，可以激活下游分子。该通路激活后，参与完成细胞的生长增殖，与多种肿瘤的发生发展有关。脂肪酸合成酶(FASN)〔4〕的主要生物学功能是从头合成长链饱和脂肪酸，机体主要靠饮食中摄取，故FASN的表达水平也较低，在多种肿瘤组织均发现FASN的表达上调。本研究探讨AKT和FASN与骨肉瘤发生发展的关系。

1 材料和方法

1.1材料来源 收集承德县中医院及承德医学院附属医院骨外科2000～2015年手术切除的30例骨肉瘤标本及骨巨细胞瘤标本，由有经验的病理科医生重新切片复诊确诊，石蜡标本4 μm用于免疫组化检测。同时收集上述新鲜组织，液氮保存，用于Western印迹检测。30例骨肉瘤标本中，男19例，女11例；病变位于胫骨上端12例，股骨下端9例，其他部位9例。全部病例经临床病史、X线和病理结合诊断。

1.2免疫组化法 实验步骤：石蜡切片常规脱蜡至水，热抗原修复，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗3次，H2O2溶液消除内源性过氧化物酶的活性，5 μl 10% 山羊血清封闭，滴加一抗，室温孵育2 h。其后PBS冲洗3次，每次5 min。分别滴加生物素标记二抗，孵育30 min，其后 PBS 冲洗3 次，每次5 min，二氨基联苯胺(DAB)溶液显色，苏木素复染细胞核5～10 s后，分化，反蓝，常规脱水、透明、封片。染色时设立阴性对照(以PBS代替Ⅰ抗)和阳性对照(由试剂公司提供)。一抗为兔抗人单克隆抗体，购自北京中杉金桥生物技术有限公司。SP试剂盒、DAB显色剂均购自福建迈新技术有限公司。判断标准：以细胞核或细胞质出现背景清晰的黄色或棕黄色颗粒为阳性。分为强着色(>95%阳性细胞)，中等着色(51%～95%阳性细胞)，弱着色(2%～50%阳性细胞)，表达缺失(<2%阳性细胞)〔5〕，本实验中把弱着色与表达缺失视为阴性表达，强着色与中等着色视为阳性表达。

1.3Western印迹检测 将新鲜组织于冷PBS中洗净血液，剪碎，加入RIPA裂解液，测定提取液的蛋白含量。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，半干转膜，转膜完毕于室温封闭2 h置于含5%脱脂奶粉的TTBS，一抗结合，4℃过夜，洗膜，每次10 min，共3次，二抗结合，化学发光法检测。

1.4统计学方法 采用SPSS18.0统计软件包进行χ2检验、相关性分析采用直线相关分析。

2 结 果

2.1免疫组化法检测AKT、FASN在骨肉瘤与骨巨细胞瘤中的表达 FASN蛋白染色阳性物位于细胞质中，AKT的阳性部位位于细胞核和细胞质，均呈深浅不一的棕黄色颗粒。AKT在骨肉瘤中的阳性表达率为70%(21/30)，显著高于骨巨细胞瘤中的表达〔26.66%(8/30)〕，差异有统计学意义(P=0.02)。FASN在骨肉瘤中的阳性表达率为56.67%(17/30)，显著高于骨巨细胞瘤中的表达〔20%(6/30)〕，差异有统计学意义(P=0.03)。

2.2Western印迹法检测AKT、FASN在骨肉瘤与骨巨细胞瘤中的表达 AKT在骨肉瘤组织中的相对表达量为0.861±0.072，显著高于骨巨细胞瘤组织中的表达(0.127±0.008)，差异有统计学意义(P<0.05)，FASN在骨肉瘤中的相对表达量为0.827±0.059，显著高于骨巨细胞瘤组织中的表达(0.218±0.012)，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

1，2：骨肉瘤；骨巨细胞瘤图1 Western印迹法检测AKT，FASN

2.3AKT、FASN与骨肉瘤临床病理特征的关系 Western印迹结果显示，AKT在骨肉瘤中的表达与患者性别、发生部位均无关，与软组织浸润及远处转移有关(P<0.05)。FASN在骨肉瘤中的表达与患者年龄、性别、发生部位均无关，有远处转移者表达有升高趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)，与软组织浸润有关(P<0.05)，见表1。

表1 AKT、FASN阳性表达骨肉临床病理特征关系

2.4AKT、FASN在骨肉瘤中的相关性 AKT、FASN蛋白在骨肉瘤中的表达呈正相关(r=0.81，P<0.01)。

3 讨 论

研究表明在多种肿瘤组织中，均发现FASN的表达上调〔6～8〕，龙新华等〔9〕认为FASN高表达在骨肉瘤转移中扮演重要的角色，并进一步研究提示，miR-424很可能通过靶向调控FASN基因影响骨肉瘤细胞侵袭和转移。刘志礼等〔10〕也应用免疫组织化学SP方法，检测60例骨肉瘤组织中FASN蛋白表达情况，以21例骨软骨瘤组织作为对照，也提示FASN蛋白在骨肉瘤组织中呈高表达，与骨肉瘤的发生及远处转移密切相关。P13K/AKT信号通路是研究较多的肿瘤相关信号通路〔11，12〕，在多种肿瘤组织中均发现过度激活，AKT是该通路的关键酶之一，其活化依赖于上游分子PI3K的激活，激活后，AKT磷酸化，变成p-AKT活化形式，进而在细胞质或细胞核对其下游蛋白发挥激活或抑制作用，最终参与细胞生长和增殖、细胞代谢、蛋白质合成等多种生物学功能。彭雅亚〔13〕发现乳腺癌中AKT表达增高与乳腺癌的浸润和侵袭转移有关，卵巢癌中也有类似发现〔14〕。本文结果显示AKT的表达与软组织浸润及转移密切相关，FASN的表达与软组织浸润相关，且均在骨肉瘤中表达上调，提示两种基因可能与骨肉瘤的发生发展有关。其可能机制为FASN表达上调能够通过降低对DDIT4de抑制作用，而使mTOR表达上调，mTOR是P13K/AKT信号通路的重要下游分子〔15〕。

4 参考文献

1刘尚文，李文刚，周大庆. 肾透明细胞癌中PTEN 和AKT 共同高表达的机制探讨〔J〕. 中华临床医师杂志，2013；7(2):657-60.

2Pande S,Browne G,Padmanabhan S,etal.Oncogenic cooperation between PI3K/Akt signaling and transcription factor Runx2 promotes the invasive properties of metastatic breast cancer cells〔J〕.J Cell Physiol，2013;228(8):1784-92.

3袁 莉,贾 莉.PI3K/AKT/PTEN 通路与肺癌的关系〔J〕.齐齐哈尔医学院学报,2013;34(18):2657-9.

4Jeong NY，Lee JS，Yoo KS，etal. Fatty acid synthase inhibitor cerulenin inhibits topoisomerase I catalytic activity and augments SN-38-induced apoptosis〔J〕.Apoptosis,2013;18(2):226-37.

5Nonaka D,Fabbri A,Roz L,etal.Reduced FEZ1/LZTS1 expression and outcome prediction in lung cancer〔J〕.Cancer Res,2005;65(4):1207-12.

6Menendez JA，Lupu R. Fatty acid synthase and the lipogenic phenotype in cancer pathogenesis〔J〕. Nat Rev Cancer，2007;7(10):763-77.

7刘 洋,李卫华,吕清涛,等.DACH1、FASN 和SREBP1 在子宫内膜癌中的表达〔J〕.山东大学学报(医学版),2013；51(4):71-6.

8周 兰,赵玉华,王晓东,等.FASN和A-FABP在乳腺浸润性导管癌中的表达及其与临床病理学特征的关系〔J〕.四川大学学报(医学版),2015;46(2):228-33.

9龙新华,刘志礼,刘家明,等.靶向调控FASN的miRNAs在不同侵袭力骨肉瘤细胞中的表达〔J〕.重庆医学,2015;44(1):7-13.

10刘志礼,罗庆丰,黄山虎,等.FASN 和p97 在骨肉瘤组织中的表达及其与骨肉瘤远处转移的关系〔J〕.实用癌症杂志,2010;25(6):591-4.

11Cohen MM Jr.The AKT genes and their roles in various disorders〔J〕.Am J Med Genet A,2013;161A(12):2931-7.

12Agarwal E,Brattain MG,Chowdhury S.Cell survival and metastasis regulation by Akt signaling in colorectal cancer〔J〕.Cell Signal,2013;25(8):1711-9.

13彭雅亚.在乳腺良恶性病变中的表达及其临床意义〔J〕.长沙医学院学报,2014;12(3):19-22.

14张海燕,孙 红.Akt 基因在上皮性卵巢癌组织中的表达及临床意义〔J〕.现代妇产科进展,2014;23(12):964-7.

15Knowles LM，Yang C，Osterman A，etal.Inhibition of fatty-acid synthase induces caspase-8-mediated tumor cell apoptosis by up-regulating DDIT4 〔J〕. J Biol Chem，2008;283(46):31378-84.