食管鳞癌组织同源异型盒B7表达及其与临床病理特征的关系

刘玉含 闫 琛 康运凯 魏 攀

(郑州人民医院检验科，河南 郑州 450003)

食管癌死亡率较高，多数患者在中晚期才被确诊，具有较高的转移率，预后差〔1〕。同源异型盒(HOX)B7属于HOX基因家族B簇成员之一，它在人类DNA的合成、转录和修复等方面发挥重要作用，HOXB7异常表达可能导致肝癌、肺腺癌、结肠癌发生〔2～4〕。本研究探讨HOXB7与食管鳞癌发生发展及转移的关系及临床意义。

1 材料和方法

1.1材料收集 25例食管鳞癌及癌旁正常食管上皮组织取自郑州人民医院手术患者，病理结果证实为食管鳞癌，其中男15例，女10例，年龄<60岁为8例，≥60岁为17例。标本收集后立即置于液氮保存，用于提取总RNA。食管鳞癌石蜡组织标本56例来自郑州人民医院病理科，其中男33例，女23例，年龄<60岁为14例，≥60岁为42例。全部样品分别在食管鳞癌癌灶组织和距离肿瘤至少5 cm以外的正常食管黏膜组织处取材，所有组织标本立即用乙醇固定，后脱水、石蜡包埋，5 μm连续切片，行组织病理学诊断和免疫组化染色。病例术前均未接受放疗、化疗或免疫治疗。

1.2主要试剂 Trizol RNA 试剂盒购自美国Invitrogen公司，逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒购自日本TAKARA公司，特异性引物购自北京奥科生物技术有限公司，琼脂糖购自西班牙Biowest公司，小鼠抗人HOXB7单克隆抗体和辣根过氧化物(HRP)标记的二抗购自美国Abcam公司，免疫组化S-P试剂盒和二氨基联苯胺(DAB)显色剂购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3RT-PCR法检测食管鳞癌组织和癌旁正常食管组织中HOXB7 mRNA的表达水平 按Trizol试剂说明书的方法提取总RNA，用紫外分光光度仪分析纯度和浓度，后取部分总RNA以1%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。收集的总RNA溶于焦碳酸二乙酯(DEPC)处理过的去离子水中，-80℃保存。cDNA的合成按照反转录试剂盒说明书进行操作，实验条件：42℃ 10 min，95℃2 min。采用Primer5.0软件设计HOXB7引物(引物序列见表1)，β-actin作为内参。基因扩增反应条件：94℃ 5 min(1个循环)；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 40 s(30个循环)；72℃ 10 min(1个循环)。取5 μl反应产物在含EB的1.8%琼脂糖凝胶上进行电泳，凝胶成像系统分析以β-actin为内参，计算HOXB7的mRNA相对表达量。HOXB7上游引物5′-TACCCCTGGATGCGAAGCTC-3′，下游引物5′-AATCTGATCTGTCTTCGTGA-3′，大小627 bp。β-actin上游引物5′-CGCCGCGCTCGTCGTCGACA-3′，下游引物5′-GTCACGCACGATTTCCCGCT-3′，大小216 bp。

1.4免疫组织化学SP法检测食管鳞癌组织和癌旁正常食管上皮组织石蜡切片中HOXB7蛋白的表达水平 用磷酸盐缓冲液(PBS，0.01 mmol/L，pH=7.4)替代一抗作为阴性对照。以英国Abcam公司提供的阳性切片作为阳性对照。HOXB7主要表达于细胞质中，以细胞质内出现棕黄色或黄褐色颗粒判读为阳性细胞。评分标准：观察并记录组织切片中的两项指标，染色阳性细胞占细胞总数的百分率和阳性细胞着色程度，综合评估试验结果。组织切片中阳性细胞占细胞总数的百分比可分为4级：阳性细胞<10%，0分，10%～25%，1分，26%～50%，2分，>50%，3分。组织切片中细胞染色强度分为3级：未着色，0分，淡黄色，1分，棕褐色2分。2项指标的结果相乘得到0分为(-)，≥1分为(+)。染色结果及评分由2位经验丰富的病理科医生独立操作进行。

1.5统计学分析 应用SPSS19.0统计学软件进行t检验或方差检验及χ2检验。

2 结 果

2.1食管鳞癌和癌旁正常食管组织中HOXB7 mRNA的表达 HOXB7 mRNA在食管鳞癌中明显高表达，而在正常食管上皮中表达较低(图1)。25例食管鳞癌标本中HOXB7 mRNA相对表达量为(0.612±0.094)，而癌旁正常食管组织中HOXB7 mRNA表达量为(0.108±0.035)，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.2食管鳞癌和癌旁正常食管组织中HOXB7蛋白的表达 食管鳞癌组织中HOXB7蛋白表达率〔62.50%(35/56)〕明显高于正常食管上皮〔16.07%(9/56)；P<0.05〕。

2.3HOXB7蛋白表达与食管鳞癌临床病理资料之间的关系 HOXB7蛋白的表达水平与食管鳞癌的组织分化程度、TNM分期、浸润程度和淋巴结转移相关(P<0.05)，不同性别和年龄患者HOXB7表达差异无统计学意义(P>0.05，表1)。

M：Marker;1,2:正常食管组织；3，4：食管癌组织图1 食管鳞癌及癌旁正常组织中HOXB7 mRNA及β-actin 的电泳条带

表1 食管癌患者不同临床病理HOXB7蛋白阳性表达差异

3 讨 论

HOXB7基因定位于人染色体17q21.3〔4〕，HOXB7基因所编码的蛋白均为转录调节因子，可与细胞外基质相关信号分子、血管内皮生长因子、黏附因子及碱性成纤维细胞生长因子等相互结合发挥作用，从而抑制或者激活相应下游靶基因序列，参与多种生物学活动〔5〕。文献证明HOXB7在胰腺癌〔6〕、胃癌〔7〕和恶性黑色素瘤〔8〕等多种恶性肿瘤中均有过度表达。赵宇清等〔9〕通过下调HOXB7基因的表达，发现卵巢癌SKOV3细胞的增殖受到抑制，细胞G1期发生阻滞，细胞凋亡增多，同时细胞周期相关蛋白CyclinD1和CyclinE表达下降，因此认为，HOXB7可直接影响细胞周期调控。本研究结果说明HOXB7在食管鳞癌中起原癌基因的作用，HOXB7可能是参与食管鳞癌进展的有价值的新的肿瘤标志物。本文结果与原薇薇等〔3〕在肺腺癌组织中研究结果大致相同，提示HOXB7过表达与食管鳞癌的侵袭和转移密切相关。

4 参考文献

1李秀娟，金春亭，范 婕，等.Oct4和Wnt1在食管鳞癌中的表达及其相关性〔J〕.中国老年学杂志，2014；34(10)：2631-2.

2张念杰，张刚庆，高 鹏，等.同源盒基因B7在肝癌组织中的表达及其临床意义〔J〕.实用医学杂志，2013；29(11)：1776-9.

3原薇薇，谭 艳，杜 敏，等.HOXB7基因在肺腺癌中的表达及其临床意义〔J〕.临床肿瘤学杂志，2014；19(11)：987-91.

4王冬清，严东旺，唐华美，等.同源异形盒基因HOXB7在结肠癌中的表达及临床意义〔J〕.中华实验外科杂志，2013；30(3)：438-40.

5Cantile M，Franco R，Schiavo G，etal.The HOX genes network in uro-genital cancers：mechanisms and potential therapeutic implications〔J〕.Curr Med Chem，2011；18(32)：4872-84.

6郭 贞，江卫华，金子良，等.下调转录因子HOXB7抑制胰腺癌BXPC3细胞侵袭及迁移机制研究〔J〕.现代肿瘤医学，2015；23(10)：1344-8.

7周崇治，韩 杨，凃威伟，等.同源盒基因家族在胃癌中差异表达的研究〔J〕.中华实验外科杂志，2013；30(7)：1507-10.

8彭思达，葛林虎，王春燕，等.siRNA对恶性黑色素瘤A375细胞中HOXB7基因的干涉作用研究〔J〕.中国肿瘤临床，2007；34(6)：312-5.

9赵宇清，黄 妍，高蜀君，等.下调HOXB7基因对卵巢癌SKOV3细胞增殖的影响及机制探讨〔J〕.中国癌症杂志，2013；23(3)：173-8.