耐多药大肠埃希菌整合子分布与细菌耐药关系分析

罗永鸿，黄永茂，林 雁，涂胡柳，钟 利，陈 庄

据近年CHINET中国细菌耐药性监测报告，大肠埃希菌是临床分离的最常见病原体之一。整合子是一类具有位点特异性重组系统的可移动遗传元件，定位于染色体、质粒、转座子中，携带耐药基因使之在同种甚至不同种属之间进行水平传播[1]。据整合酶基因编码氨基酸序列不同进行分类，其中较常见的是Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类整合子，整合子广泛存在于革兰氏阴性菌中，其与细菌耐药性密切相关[2]。本文通过检测临床分离的大肠埃希菌Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类整合酶基因，分析其与细菌耐药性的关系，为临床合理应用抗生素提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 菌株来源 2014年7月～2014年11月从西南医科大学附属医院住院病例送检标本中随机抽样获得大肠埃希菌共147株(不含同一病例不同部位重复分离菌株)，所有菌株均经全自动细菌鉴定仪VITEK系统确认为大肠埃希菌。质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922。

1.2 主要试剂 药敏纸片、M-H琼脂、LB肉汤粉、细菌基因组DNA提取试剂盒(购自TIANGEN公司)、2×TaqPCRMasterMix、4对引物(由上海生工生物公司合成)，引物序列[3]。见表1。

表1 靶基因引物序列及长度

1.3 主要仪器 立式压力蒸汽灭菌锅、单人双面无菌超净工作台、37℃恒温培养箱、离心机、PCR反应仪、凝胶DNA成像仪等。

1.4 药敏实验 在M-H琼脂培养基上采用K-B法对临床分离的147株大肠埃希菌进行药敏试验。药敏纸片：CTX、CAZ、PIP、CIP、LEV、NA、NOR、GEN、AMK、SXT。结果判读根据美国CLSI2016年指南分为三个类别:耐药(R)、中介(I)、敏感(S)。

1.5DNA提取 采用细菌基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN公司)，按说明书所提供步骤对临床分离的147株大肠埃希菌进行基因组DNA的提取。

1.6 目的基因的检测 将上述引物应用PCR法进行目的基因的扩增。PCR反应体系包括：模板DNA0.5μL、P1 1μL、P2 1μL、2×MasterMix10μL、ddH2O7.5μL,总反应体系为20μL。PCR扩增产物热循环参数均为:94℃预变性3min,然后94℃ 30s、58 ℃ 30s、72 ℃ 30s, 循环 32周期, 最后72℃延长5min。再挑选整合子阳性菌株在上述条件下进行可变区基因盒的扩增。所有产物于2%琼脂糖凝胶电泳，选取电泳条带大小相同的各三个，送至上海生工生物公司进行测序。使用BLAST(BasicLocalAlignmentSearchTool)将所测序列与Genbank数据库比对分析，确定整合子可变区内所含的基因盒种类。

1.7 统计学方法 使用SPSS20.0统计软件，采用卡方检验或Fisher精确概率法进行统计学分析。

表2 147株大肠埃希菌药物敏感实验

2 结 果

2.1 药敏结果

147株大肠埃希菌对11种临床常见抗菌药物敏感实验结果见表2，其中链霉素、萘啶酸、复方新诺明、哌拉西林耐药率高，分别占70.07%、82.31%、66.67%、68.03%；对丁胺卡那霉素耐药率低，为3.40%。147株大肠埃希菌中有多耐药菌株102株(69.39%)，其中耐药模式以PIP+NOR+NA+SXT最常见，双耐药29株(19.73%)，单耐药10株(6.80%)，全敏6株(4.08%)。

注：M为DNAmakerI，1为空白对照

图1部分大肠埃希菌Ⅰ类整合酶基因扩增电泳图

2.2 整合子检测结果

临床分离的147株大肠埃希菌中，携带Ⅰ类整合酶基因的菌株有98株，其中在多耐药菌株中检出84株，双耐药菌株中检出12株，全敏菌株中检出2株，单耐药菌株中未检出。部分大肠埃希菌Ⅰ类整合酶基因扩增电泳图见图1。Ⅰ类整合子阳性菌株与阴性菌株对11种抗菌药物的耐药率比较见表3。未检测出Ⅱ、Ⅲ类整合子。

表3 大肠埃希菌Ⅰ类整合子阳性菌株与阴性菌株耐药率

Ⅰ类整合酶基因在不同耐药模式中检出率比较见表4，两两比较提示：多耐模式与双耐模式、多耐模式与单耐模式、双耐模式与单耐模式、多耐模式与全敏模式，差异有统计学意义(P<0.05)。

表4 不同耐药模式中Ⅰ类整合子检出率比较

2.3 Ⅰ类整合子可变区检测结果

98株携带Ⅰ类整合子的大肠埃希菌中有74株扩增出可变区基因盒，其中包含100-200bp(7株)、600-800bp(4株)、1200bp(63株)三种不同条带，将上述条带测序结果与Genbank已登录的序列进行比对。100-200bp条带经测序比对为aac(6')-Ib-cr，与Genbank中登录号为KY788352序列一致(同源性为98%)，编码氨基糖苷乙酰转移酶，赋予细菌对氨基糖苷类抗菌药物耐药；600-800bp条带经测序比对有dfrA5、dfrA7、aac(6')-Ib+cmlA1，dfrA5与Genbank中登录号为HQ880248序列一致(同源性为99%)、dfrA7与Genbank中登录号为EU250576序列一致(同源性为99%),编码二氢叶酸还原酶，赋予细菌对甲氧苄啶耐药，aac(6')-Ib+cmlA1与Genbank中登录号为JN108884序列一致(同源性为100%)，编码氨基糖苷乙酰转移酶+氯霉素外排泵，赋予细菌对氨基糖苷类+氯霉素抗菌药物耐药；1200bp条带经测序比对为dfrA17-aadA5，与Genbank中登录号为DQ322597序列一致(同源性为99%)，编码二氢叶酸还原酶+氨基糖苷类腺苷酰转移酶，赋予细菌对甲氧苄啶+氨基糖苷类抗菌药物耐药。

3 讨 论

整合子作为可移动遗传元件之一，在耐药基因的获取、表达、传播中发挥重要作用。目前发现的基因盒达数千种，其中大部分功能是未知的，目前已知的耐药基因盒大约有130种，常见的耐药基因有dfrA(甲氧苄啶)、aadA(链霉素)、qacE(季铵盐化合物)[2]。整合子具有存储、重排、表达基因盒的能力，在抗生素的选择压力下，细菌可以快速适应环境。本研究中，临床分离的102株多耐药大肠埃希菌中检测出Ⅰ类整合子阳性菌株84株，Ⅰ类整合子与多重耐药之间存在显著相关性(P<0.05)，且多耐模式分别与双耐模式、单耐模式、全敏模式比较有显著差异，表明携带Ⅰ类整合子的大肠埃希菌更容易表现为多耐药模式。Singh，T等研究也表明Ⅰ类整合子与细菌的耐药性密切相关[4]。在Ⅰ类整合子阳性菌株中存在2株对临床常用抗菌药物全部敏感，这可能与整合子缺乏相应基因盒或整合子无法表达有关。

本研究中147株大肠埃希菌携带Ⅰ类整合酶基因的有98株(66.67%)，与黄永茂[5]对该院2007年7月～2008年7月临床分离的71株大肠埃希菌携带Ⅰ类整合子情况(74.65%)相比有所下降，分析原因可能与近年来医院对抗菌药物的严格管控有关或本研究样本量较前增大提高了数据的真实性。

Ⅰ类整合子阳性菌株对链霉素、庆大霉素、复方新诺明的耐药率均高于阴性菌株(P<0.05)。这可能与整合子携带的耐药基因盒有关。dfrA、aadA、aac(6')-Ib分别通过编码二氢叶酸还原酶、氨基糖苷腺苷酰转移酶、氨基糖苷乙酰转移酶，赋予对甲氧苄啶、链霉素、庆大霉素耐药，同时整合子3'-保守区携带sul基因介导对磺胺类抗菌药物耐药[6]。然而，Ⅰ类整合子阳性的大肠埃希菌不仅对携带相应基因盒的抗菌药物敏感性降低，而且对其他抗菌药物耐药性提高，其中Ⅰ类整合子阳性菌株对头孢他啶、头孢噻肟、哌拉西林、环丙沙星、左氧氟沙星、萘啶酸、诺氟沙星耐药率均高于阴性菌株(P<0.05)，但未检出相应基因盒，上述现象表明可能有其他耐药机制的存在。

本研究中147株大肠埃希菌中有98株携带Ⅰ类整合酶基因，其中有24株未扩增出可变区，这可能与有些整合子缺乏3'-保守区、没有引物杂交位点、早期终止密码子的存在等有关[7]。

细菌的耐药问题成为全球公共卫生问题之一，对抗菌药物耐药性的持续监测为有效治疗大肠埃希菌感染提供重要信息。多项研究表明Ⅰ类整合子与多重耐药之间存在显著相关性，因此整合子可作为多耐药菌株全面可靠的分子标记[8]。

【参考文献】

[1]HALLRM,COLLISCM.Mobilegenecassettesandintegrons:captureandspreadofgenesbysite-specificrecombination[J].MolMicrobiol, 1995, 15(4): 593-600.

[2]GILLINGSMR.Integrons:past,present,andfuture[J].MicrobiolMolBiolRev, 2014, 78(2): 257-277.

[3]GOLDSTEINC,LEEMD,SANCHEZS,etal.Incidenceofclass1and2integrasesinclinicalandcommensalbacteriafromlivestock,companionanimals,andexotics[J].AntimicrobAgentsChemother, 2001, 45(3): 723-726.

[4]SINGHT,DASS,RAMACHANDRANVG,etal.DistributionofIntegronsandPhylogeneticGroupsamongEnteropathogenicEscherichiacoliIsolatesfromChildren<5YearsofAgeinDelhi,India[J].FrontMicrobiol, 2017, 8: 1-13.

[5] 黄永茂，吴志鹃，陈枫，等. 大肠埃希菌Ⅰ类整合子与多药耐药的相关性探讨[J]. 中华医院感染学杂志， 2011, (14): 2882-2885.

[6] 姜波，魏取好， 吕火祥. 尿液分离大肠埃希菌Ⅰ类整合子分子特征与耐药性的关系研究[J]. 中华医院感染学杂志，2014，(01): 5-8.

[7]KHEIRIR,AKHTARIL.AntimicrobialresistanceandintegrongenecassettearraysincommensalEscherichiacolifromhumanandanimalsourcesinIRI[J].GutPathog, 2016, 8(1): 1-10.

[8]GILLINGSMR,GAZEWH,PRUDENA,etal.Usingtheclass1integron-integrasegeneasaproxyforanthropogenicpollution[J].Ismej, 2015, 9(6): 1269-1279.