食源性乳酸菌在改善烟叶品质中的应用

杨 娟，米其利，熊 文，朱瑞芝，楼牧梦，夭建华，*，罗义勇，*

(1.昆明理工大学 生命科学与技术学院，云南 昆明 650500； 2.云南中烟工业有限责任公司 技术中心，云南 昆明 650106)

烟叶陈化，又称烟叶发酵，是烟草加工过程中的一个重要加工单元。烟叶陈化实质是在一定温度和湿度条件下，烟叶理化特性发生深刻变化，烟叶香气、色泽和吸味品质明显改善的加工过程。烟叶陈化分为自然陈化和人工陈化。自然陈化指烟叶在自然条件下进行长时间发酵的一种方法；人工陈化是通过人为控制发酵的温度和湿度，在短时间内显著改善烟叶品质的一种方法。人工陈化可大大缩短发酵时间，但发酵后烟叶内各种成分比例不协调，发酵效果差；自然陈化对烟叶改善效果好，但耗时较长，易造成库存积压，影响经济效益。另外，在长期仓储陈化过程中，烟叶易霉变和长虫，给烟草企业造成严重经济损失。

据报道，陈化烟叶表面存在大量微生物群落，包括占绝对优势细菌、少量放线菌和真菌[1-2]。缩短发酵时间、增进烟叶香气、调控烟叶有害成分(如烟碱、亚硝胺等)是微生物作用陈化烟叶的3个主要功能[3]。微生物改善陈化烟叶吸食品质的原因主要有以下两方面：1)进行代谢活动降解或消耗烟叶中一些大分子物质(如糖类、脂类和蛋白质等)，改善了烟草的吃味，增加余味；2)通过代谢产生某些致香小分子物质(如醇类、酯类、酸类和杂环类等)，使烟叶各种成分比例趋于平衡，提高烟叶质量。

将微生物资源应用于烟叶发酵是改善烟叶品质和增进烟叶香气的一种重要措施。早在1958年，Izquierdo[4]发现，接种微生物发酵的烟叶香气和性状均得到改善，采用微球菌属(Micrococcus)或芽孢杆菌属(Bacillus)或两者的混合物接种烟叶时，效果更为显著。English等[5]利用枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和环状芽孢杆菌(B.circulans)分别或混合发酵烟叶后，能迅速产生一种令人愉悦的香气。黄静文等[6]将短小芽孢杆菌(B.pumilum)菌剂喷施于烟丝发酵21 d后，烟叶化学成分比例更加协调，烟香和烟气增加，刺激性降低，卷烟吸味显著改善。此外，利用微生物酶制剂处理改善烟叶品质和香气的报道也较多。李雪梅等[7]用烟碱降解活性较高菌株Nic22的粗酶液处理上部烟叶，评吸结果显示，经酶液处理后的烟叶可明显减轻杂气和刺激性，提高卷烟感官质量。

乳酸菌是传统发酵食品中的主要菌群，长期定居于人类肠道并有益于人体健康，是公认的食品级安全微生物，被广泛应用于酸奶、奶酪、馒头等食品的风味塑造。目前，应用在烟叶上的微生物大多分离自烟叶表面或土壤中，鉴定发现有些是条件致病菌[8]，所以存在一定安全隐患。食品来源有益微生物应用在烟叶发酵上的报道较少，而利用乳酸菌改善烟叶风格的报道仅有2例。甄达文等[9]在利用酶制剂和微生物发酵制备烟用香料时发现，德氏乳酸菌(Lactobacillusdebrueckii)+生香酵母组合发酵制得的香料，增香效果明显，感官评吸效果最佳。潘家华等[10]报道了一种加速烟叶陈化和提升烟叶品质的复合微生物制剂专利，该制剂包括植物乳杆菌(L.plantarum)和热醋酸杆菌(Clostrioliumthemoacidophilus)，发酵烟叶后，可增加卷烟陈化酸香和柔和细腻烟气，降低卷烟刺激性，使卷烟的吸食口感变好。本研究从中国传统发酵食品豆豉中分离得到了两株植物乳杆菌L8和L14菌株，将其菌剂用于烟叶发酵，并优化其发酵产香条件以及研究发酵后对卷烟化学成分和致香成分的影响，旨在探讨利用食品级乳酸菌改善烟叶品质的可行性。

1 材料与方法

1.1 烟叶、烟丝和培养基

实验用烟叶由云南中烟有限责任公司原料部提供，品种为K326，具有1年陈化龄；烟丝是从商品化云烟紫云中抽出，用于后续菌种筛选、感官评吸和致香成分测定。

MRS液体培养基组分如下：1%蛋白胨，0.8%牛肉粉，0.4%酵母粉，2%葡萄糖，0.1%吐温80，0.2% K2HPO4，0.5% NaAc，0.2‰ MgSO4，0.05‰ MnSO4，0.2%柠檬酸三铵，pH 6.2，配制后置于灭菌锅中115 ℃灭菌20 min；用于食源性乳酸菌的培养和保藏。

MRS固体培养基：MRS液体培养基中添加1.5%琼脂。

改良MRS固体培养基：在MRS液体培养基中添加1% CaCO3、0.04‰溴甲酚紫和1.5%琼脂，115 ℃灭菌20 min，用于食源性乳酸菌筛选。

烟叶培养基由0.8%烟叶粉末(由烟叶在研钵中研磨而成)和1.5%琼脂配制而成，115 ℃灭菌20 min后，倒平板，用于筛选以烟叶为唯一营养源的乳酸菌。

1.2 乳酸菌的分离与鉴定

从云南各州县采集豆豉样品若干份，利用改良MRS固体培养基筛选乳酸菌，单菌落在MRS液体培养基中过夜培养后，保存于-80 ℃冰箱中。随机选取10株乳酸菌，在烟叶培养基中划线分离，37 ℃培养48 h。选取2株长势最好菌株，接种于MRS固体培养基，37 ℃培养48 h后，观察菌落形态，并且参照Adnan等[11]报道方法进行生理生化分析。利用细菌基因组提取试剂盒(中国百泰克公司)提取L8和L14基因组DNA。然后，以16S rRNA和dnaK基因为分子Marker，进行PCR扩增、测序和序列在线检索。最后，结合形态、生理生化和分子分析结果，确定菌株身份信息。

1.3 菌株生长曲线和产酸曲线

从-80 ℃冰箱中取出菌株保藏液，按4‰(V/V)接种至5 mL MRS液体培养基中，进行活化。活化好的菌液按4‰(V/V)接种于100 mL MRS液体培养基中，30 ℃静止培养40 h。每隔2 h取样4 mL，其中3 mL用于D600和pH测定；1 mL用MRS液体培养基进行10倍系列稀释，取10-8和10-9两个稀释度各100 μL涂布于MRS固体平板，30 ℃静止培养18 h后，记录菌落形成单位(colony-forming unit，CFU)数。实验重复3次。

1.4 烟丝发酵和发酵条件优化

用切丝机将烟叶切成烟丝，称取含水率为12%烟丝30 g，喷施6 mL乳酸菌菌剂(浓度为1×109CFU·mL-1，菌龄为20 h)，装入无菌食品袋中，30 ℃，60%湿度，恒温恒湿培养箱中发酵7 d后，制成卷烟。为获得最佳发酵条件，按照正交实验表(表1)对接菌量、发酵温度、菌龄和烟叶产地进行优化。

另外，以紫云烟丝为发酵材料，采用正交实验最优条件，进行发酵并制作卷烟。对照样品为等量无菌水代替乳酸菌菌剂，其他步骤同相应发酵卷烟。

1.5 感官评吸

将各种发酵卷烟和相应对照样品随机编号，放入恒温恒湿培养箱中平衡24 h后，由云南中烟工业有限责任公司技术中心组织5名省级评吸专家进行评吸。烟叶感官质量按照表2所述指标和评分标准进行评价，评吸得分越高，卷烟抽吸品质越好，反之亦然。每个样品重复评吸3次。

1.6 烟样化学成分测定

以紫云发酵烟丝和对照样品为检测对象，采用连续流动分析法，参考烟草行业标准YC/T 159—2002、YC/T 468—2013、YC/T 468—2013，分别测定总糖和还原糖，总氮，总植物碱的含量。

1.7 烟样致香成分分析

1.7.1 顶空-固相微萃取技术分离致香成分

分别称取0.5 g紫云发酵烟丝和对照样品于顶空瓶中，插上老化好的萃取头，将石英纤维头推出使其暴露在顶空瓶顶空中，在电热恒温水浴锅中60 ℃萃取40 min后，将吸附好待分析组分的萃取头插入气相色谱-质谱联用仪进样器中。

1.7.2 气相色谱-质谱联用技术鉴定和分析致香成分气相色谱条件：色谱柱为DB-WAXetr型毛细管柱(60 mm×0.25 mm×0.25 μm)(美国Agilent公司)；程序升温为初始温度60 ℃，保持5 min；以2 ℃·min-1的升温速率升至200 ℃；再以10 ℃·min-1的升温速率升至240 ℃，保持10 min；进样口温度180 ℃；载气为高纯氦气；恒流模式，柱流量1.5 mL·min-1，分流比10∶1。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Orthogonal test factor levels

—表示该水平未设置。
— indicates level 3 was not set.

表2 感官评价指标和评分标准Table 2 Sensory evaluation index and scoring standard

—表示术语和赋值不存在；括号里数据表示评吸分值。
— indicates terminology and assignment not existed; Data in parentheses represent smoking score.

质谱条件：电离方式为电子轰击源；电离能量70 eV；传输线温度180 ℃；离子源温度200 ℃；溶剂延迟4 min；检测离子范围为33～400 amu。

对采集到的质谱图利用Wiley和NIST谱库进行串联检索，确定挥发性成分种类，并利用峰面积归一化法计算各成分在样品中的相对含量。每个烟样重复3次。

1.8 数据分析

利用SPSS 22软件包中的Student’s t-test分析对照和处理烟样中的数据差异。

2 结果与分析

2.1 以烟叶为唯一营养源的乳酸菌筛选和鉴定

在改良MRS固体平板上，菌落颜色为淡黄色或者乳白色，菌落周围紫色溴甲酚紫变为黄色，且有明显溶钙圈的单菌落，初步确定为乳酸菌。在10株乳酸菌中，6株能在烟叶固体培养基上生长，将长势最好的两株分别命名为L8和L14，作为下一步实验菌株。L8和L14菌落形态规则、圆形、中间隆起、乳白色、表面光滑、边缘整齐。显微观察发现L8和L14均为短杆状，无鞭毛，革兰氏阳性，过氧化氢酶阴性。分子生物学鉴定分析显示，菌株L8和L14的16S rDNA 和dnaK序列与植物乳杆菌均具有很高的同源性(大于99%)。这些结果可确定L8和L14均为植物乳杆菌。

2.2 菌株L8和L14的生长和产酸特性研究

生长曲线分析显示，L8从6 h进入指数生长期，在14 h进入稳定生长期，22 h后菌落数和D600值开始下降，推测其可能开始进入衰亡期(图1-A)。与L8不同，L14大约在6、20和34 h分别进入指数生长期、稳定生长期和衰亡期(图1-B)。产酸曲线显示L8和L14相似，pH值从最初6.1～6.4开始缓慢下降到指数生长初期的5.7～6.0，然后急剧下降，在指数末期两菌株均下降了2.0～2.2，最后在稳定期和衰亡期维持在3.3～3.6(图1)，说明L8和L14均具有很强的产酸能力(图1-B)。

CFU表示菌落形成单位。CFU denotes the colony-forming unit.图1 L8(A)和L14(B)生长和产酸曲线Fig.1 The curves of growth and acid production of L8 (A) and L14 (B)

2.3 卷烟感官评吸和产香发酵条件优化

用L8和L14发酵陈化烟叶，制得的卷烟按实验所述方法进行感官评吸。结果表明，乳酸菌发酵卷烟比对照虽然烟味较淡，但整体口感更好，烟气细腻醇和，入口滑顺，杂气、刺激性和苦辣味明显减轻，酸香味明显增加。按照表2所述评分指标和评分标准，在总评分为45的情况下，L8和L14发酵卷烟分值显著高于对照(表3)。正交试验结果表明，L8和L14发酵卷烟在接菌量为1×108CFU·mL-1、发酵温度为37 ℃、菌龄为10 h和烟叶产地为云南保山的条件下，感官评吸值均最高，分别为34.1和33.41(表4)，表明上述条件为L8和L14的最佳产香发酵条件。

为了更直观、明确地评价L8和L14对卷烟吃香味的影响，以紫云烟丝为发酵材料，选取去除烟叶产地外的最优产香发酵条件制备发酵卷烟。感官评吸表明，L8和L14发酵卷烟分值均大于对照(表3)，具体来说，发酵后卷烟虽然香气量较少，但协调性更好，杂气和刺激性减少，酸香味增强，余味干净，说明乳酸菌L8和L14能显著改善烟叶吸食品质。

2.4 烟样经乳酸菌发酵后的化学成分变化

主要常规化学成分分析结果表明，紫云烟丝经L8和L14发酵后，总氮和总植物碱含量没有变化，但总糖和总还原糖含量显著减少，造成糖氮比由10.11降低至9.41和9.51，糖碱比由9.16降低至8.49和8.59(表5)。

2.5 烟样经乳酸菌发酵后的致香成分变化

由表6可知，经L8和L14处理后，烟丝中致香物质的种类主要包括酸、醛、酮、醇等4大类，它们含量均超过了10%，其中醛的含量最多。具体来说，L8和L14发酵烟丝较对照增加(例如2-甲基丁酸)或减少(例如壬醛)了一些化合物种类，但这些化合物含量均很少。含量较多且变化很明显的化合物有乙酸和3-甲基丁醛，其中乙酸含量增加了9.17%～11.89%，3-甲基丁醛含量减少了7.90%～8.43%，使得总酸含量和总醛含量分别显著增加和减少。另外，一些含量较少但统计学分析显示发酵烟丝与对照间存在显著性差异的化合物有：丙酸、5-甲基呋喃醛、2-甲基呋喃、三氯甲烷和1，3-二甲基苯。这些化合物含量变化可能是L8和L14改善烟叶吸食品质的主要原因。值得一提的是，L14比L8对烟叶改造似乎更具效果，例如乙酸的增加量和3-甲基丁醛的减少量在L14发酵烟丝中均最大；另外，L14显著降低烟碱含量，但L8与对照差异不显著(表6)。

表3 L8和L14发酵卷烟感官评吸Table 3 Sensory evaluation of L8 and L14 fermented tobacco

—表示未测定；*和**分别表示相比于对照，L8或L14具有显著性差异(P<0.05和P<0.01)。下同。
— indicates no determination;*and**represents the significance between L8 or L14 and the control (P<0.05 andP<0.01) , respectively. The same as below.

表4 正交试验结果Table 4 Results of orthogonal test design

表5 L8和L14处理对烟丝主要化学成分的影响Table 5 The impact of L8 and L14 on the chemical components in cut tobacco

表6 L8和L14发酵对烟丝致香成分的影响Table 6 Effect of L8 and L14 fermentation on volatile aroma components in cut tobacco

续表6

相对含量指一种烟丝中单一化合物峰面积占总化合物峰面积的比例；—，未检测到；M2B，2-甲基-2-丁烯醛；M1B，3-甲基-1-丁醇；M2FM，5-甲基-2-呋喃甲醇；M2H，6-甲基-2-庚醇；EMMD2K，(E)-8-甲基-5-(1-甲基乙基)-6，8-壬二烯-2-酮；MA2K，6-甲基-5-庚烯-2-酮；EMKB1K，(E)-1-(2，6，6-三甲基-1，3-环己二烯-1-基)-2-丁烯-1-酮；MTF3K，2-甲基四氢呋喃-3-酮；CTK，2-环戊烯-1，4-二酮； MP4K，2，3-二氢-3，5-二羟基-6-甲基-4H-吡喃-4-酮；A2A，乙酰氧基-2-丙酮；PGD，1，2-丙二醇二乙酸酯；TN，1，2，3，4-四氢-1，1，6-三甲基萘；HMI，2，3-二氢-1，1，5，6-四甲基-1H-茚。
The relative content refers to the ratio of the peak area of the single compound to the peak area of the total compound in a kind of tobacco; —，not detected; M2B，2-methyl-2-butenal; M1B，3-methyl-1-butanol; M2FM，5-methyl-2-furancarbinol; M2H，6-methyl-2-heptanol; EMMD2K，(E)-8-methyl-5-(1-methylethyl)-6，8-nondiene-2-one; MA2K，6-methyl-5-heptadien-2-one; EMKB1K，(E)-1-(2，6，6-trimethyl-1，3-cyclohexadien-1-yl)-2-buten-1-one; MTF3K，2-methyltetrahydrofuran-3-one; CTK，2-cyclopentene-1，4-diketone; MP4K，2，3-dihydro-3，5-dihydroxy-6-methyl-4H-pyran-4-one; A2A，acetyl oxygen-2-acetone; PGD，1，2-propyleneglycol diacetate; TN，1，2，3，4-tetrahydro-1，1，6-trimethyl-naphthalene; HMI，2，3-dihydro-1，1，5，6-tetramethyl-1H-indene.

3 讨论

利用微生物发酵，能减弱烟叶中杂气和刺激性，提高烟叶吃香味，显著改善烟叶品质和等级[4-5，12]。我们的研究结果发现，经L8和L14发酵处理后的烟叶，烟气细腻醇和，杂气和刺激性明显减弱，酸香味突显，余味干净，说明乳酸菌能改善烟叶吸食品质，是一类潜在卷烟风味改善菌种资源。

烟叶化学成分是烟叶吃吸味的物质基础。微生物发酵能够加速烟叶化学成分变化，缩短烟叶陈化时间。相对于对照，L8和L14发酵烟丝的糖氮比和糖碱比均有不同程度下降(表5)，但均位于烤烟糖氮比和糖碱比最佳范围[13]，这和瞿娇娇等[14]应用食品微生物改善烟叶品质的研究结果一致。这些变化可能使烟叶的糖、氮和碱等主要化合物及其比值更加趋于平衡，促进烟叶品质改善。

致香成分变化结果显示，经L8和L14处理后，烟丝中一些化合物种类发生了改变，但这些化合物含量均很少(表6)，很难说明这些化合物种类的改变是由于实验误差还是由乳酸菌发酵造成的，所以总体来说，乳酸菌发酵处理对烟丝致香成分的种类改变不明显。在化合物含量方面，发酵后烟丝的总酸(尤其是乙酸)含量增加，总醛(尤其是3-甲基丁醛)含量减少(表6)，推测3-甲基丁醛可能通过乳酸菌代谢生产乙酸。由于戊醛、丁烯醛类等醛类物质在烟气中往往引起吸食刺激，杂气重，余味差[15]，而有机酸可以减少卷烟杂气和刺激，提高细腻度和圆润感，改善余味，有利于烟叶的吸味品质提高[9]。

在本研究中，我们筛选和鉴定了2株乳酸菌(植物乳杆菌L8和L14)，并绘制了这2种菌株的生长和产酸曲线。利用L8和L14发酵烟丝，感官评吸结果表明L8和L14能显著提高卷烟吸食品质，并基于感官评吸获得了L8和L14最佳产香发酵条件。烟叶化学成分与致香成分分析表明，发酵后烟丝中主要化学成分比例更加协调，一些致香成分含量发生显著改变，其中3-甲基丁醛可能转变成更多乙酸，这些变化可能是L8和L14改善烟叶品质的主要原因。

参考文献(References)：

[1] 朱大恒，陈锐，陈再根，等. 烤烟自然醇化与人工发酵过程中微生物变化及其与酶活性关系的研究[J]. 中国烟草学报，2001，7(2): 26-30.

ZHU D H，CHEN R，CHEN Z G，et al. The relationship between microorganisms and enzyme activities in flue-cured tobacco during aging and fermentation[J].ActaTabacariaSinica，2001，7(2): 26-30. (in Chinese with English abstract)

[2] 单宏英. 陈化烟叶表面有益微生物的分离筛选、鉴定及应用研究[D]. 杨凌: 西北农林科技大学，2012.

SHAN H Y. Studies on screening identification and application of beneficial microorganisms isolated from aging tobacco surfaces[D]. Yangling: Northwest A&F University，2012. (in Chinese with English abstract)

[3] 黄静文. 陈化烟叶表面的细菌多样性及短小芽孢杆菌改善烟叶品质的研究[D]. 昆明: 云南大学，2010.

HUANG J W. Bacterial diversity on aging flue-cured tobacco leaves and improvement the tobacco leaves’ quality byBacilluspumilus[D]. Kunming: Yunnan University，2010. (in Chinese with English abstract)

[4] IZQUIERDO T A. Bacteria in tobacco fermentation[J].Coresta，1958 (2): 2146.

[5] ENGLISH C F，BELL E J，BERGER A J. Isolation of thermophiles from broad leaf tobacco and effect of pure culture inoculation on cigar aroma and mildness[J].AppliedMicrobiology，1967，15(1): 117-119.

[6] 黄静文，段焰青，者为，等. 短小芽孢杆菌改善烟叶品质的研究[J]. 烟草科技，2010 (8): 61-64.

HUANG J W，DUAN Y Q，ZHE W，et al. Improvement of flue-cured tobacco quality withBacilluspumilus[J].TobaccoScience&Technology，2010 (8): 61-64. (in Chinese with English abstract)

[7] 李雪梅，杨伟祖，祝明亮，等. 烟碱降解菌的选育及改善上部烟叶品质研究[J]. 工业微生物，2006，36(1): 16-22.

LI X M，YANG W Z，ZHU M L，et al. Screening and fermentation of nicotine-decomposing microorganisms and improving treatment of upper-tobacco leaves quality[J].IndustrialMicrobiology，2006，36(1): 16-22. (in Chinese with English abstract)

[8] CHOPYK J，CHATTOPADHYAY S，KULKARNI P，et al. Mentholation affects the cigarette microbiota by selecting for bacteria resistant to harsh environmental conditions and selecting against potential bacterial pathogens[J].Microbiome，2017，5: 22.

[9] 甄达文，于铁妹，朱珊珊，等. 利用酶法与微生物发酵法制备天然烟用香料[J]. 食品工业科技，2009，30(12): 268-272.

ZHEN D W，YU T M，ZHU S S，et al. Preparation of natural tobacco flavor by enzyme and microorganism[J].ScienceandTechnologyofFoodIndustry，2009，30(12): 268-272. (in Chinese with English abstract)

[10] 潘家华，黄龙，庞登红. 加速烟叶陈化和提升烟叶品质的复合微生物制剂及其应用：CN103202533A[P]. 2013.07.17.

[11] ADNAN M，FARIS A，TAN I K P. Isolation of lactic acid bacteria from Malaysian foods and assessment of the isolates for industrial potential[J].BioresourTechnology，2007，98(7): 1380-1385.

[12] 赵铭钦，李晓强. 烟叶微生物发酵机理及生物制剂应用研究进展[J]. 甘肃农业大学学报，2007，42 (6): 84-91.

ZHAO M Q，LI X Q. Revies of the action mechanism of microbe in tobacco fermentation and application of biologic preparation[J].JournalofGansuAgriculturalUniversity，2007，42(6): 84-91. (in Chinese with English abstract)

[13] 肖协忠. 烟草化学[M].北京: 中国农业科学出版社，1997.

[14] 瞿娇娇，施鸣，张庆明，等. 食品微生物对发酵烟叶品质的影响[J]. 贵州农业科学，2012，40(3): 136-l38.

QU J J，SHI M，ZHANG Q M，et al. Effect of food microorganisms on quality of fermented flue-cured tobacco[J].GuizhouAgriculturalSciences，2012，40(3): 136-l38. (in Chinese with English abstract)

[15] 陈笃建. 产香酵母对低次烟叶吸食品质的影响[J]. 贵州农业科学，2013，41(4): 44-47.

CHEN D J. Effects of aroma-producing yeast on smoking quality of low grade tobacco leaves[J].GuizhouAgriculturalSciences，2013，41(4): 44-47. (in Chinese with English abstract)