荧光成像系统对比度分析与成像仿真

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(1.沈阳药科大学 医疗器械学院, 辽宁 本溪 117004;2.沈阳仪表科学研究院有限公司, 辽宁 沈阳 110043)

引 言

荧光成像技术在医学及生物领域得到了越来越广泛的应用,荧光显微镜是最早出现的一种荧光成像系统,后续其他种类的荧光成像系统也逐渐产生并被采用[1]。荧光成像系统涉及许多设计环节,比如当观测样品更换不同荧光染料时,或厂商升级开发新设备时,往往需要参数论证和产品实验来实现好的成像效果[2-3]。以系统核心光学元件滤光片为例,开发新产品需经过指标评估、产品设计评审、膜系设计、样品的试制、测试实验等环节,开发周期较长[4]。此外,由于滤光片用途的差异,尽管波长范围较为接近,但对于成像应用领域来说指标冗余,造成不必要的原料消耗和成本升高。最后,单独从荧光染料和滤光片组的曲线匹配上判断,很难直观反映系统的观察结果,系统厂商也很难提出非常准确的参数要求来匹配新设备。这些原因导致需要反复进行样品试制和验证,增加了研制周期。

综上考虑,为了快速验证各模块光谱参数是否匹配且能直观反映系统成像效果,本文提出了荧光成像链路模型。通过该模型对系统成像对比度进行了分析并得到了仿真成像效果,希望该仿真方法能对各类荧光系统的设计和效果评价提供一定帮助和借鉴。

1 原 理

荧光成像系统包括光源、荧光染料、滤光片组、成像光路、CCD图像采集等模块。以荧光显微镜为例,与普通成像系统不同,滤光片在荧光系统中分离和选择物质的激发光与发射荧光的特征波段光谱,决定了图像的背景与信号亮度及对比度[3]。因此,影响成像对比度和背景噪声的核心器件是滤光片组。荧光物质受到激发发射荧光的时间短暂,荧光的辐射强度相对于激发光源的反射光强度要微弱很多,通常仅为万分之一的数量级[4-6]。本文忽略成像CCD的光谱响应及噪声对成像系统的影响,集中分析滤光片组及各模块间匹配性对成像效果的影响。

荧光染料的荧光发射辐射强度不仅与物质分子有关,还与激发光的强度、染料浓度等因素有关。根据理论分析[7],荧光物质在一定浓度范围内,荧光强度可以表示为:

If=kI0

(1)

式中:I0为激发光的辐射强度;k为与染料消光系数、量子产率、浓度有关的系数。

成像系统的背景噪声主要来自光源在光路的漫反射光、系统外部的环境光以及CCD成像器件的暗电流噪声。荧光成像系统通常在暗室环境下操作,因此背景噪声大小即背景光强度主要由光源的漫反射光决定。背景光的辐射强度表示为:

Ib=RI0

(2)

式中:R为光路中的漫反射率;I0为光源的辐射强度。通过前面分析可知,k/R应具有10-4的数量级。

荧光成像系统的成像链路如图1所示。

图1 荧光成像系统成像链路Fig.1 Imaging chain of fluorescence imaging system

根据链路模型分析,光源通过荧光激发片,形成一定波段分布的激发光。每个波长的激发光都会激发出有特定光谱范围的荧光。激发光的波长不同,荧光激发效率也发生变化。发射的荧光经过发射片,通过成像光路最终进入CCD成像器件。在可见光范围内,CCD的光谱响应曲线变化较为平缓,为了简化模型,将CCD光谱响应率在可见荧光发射带宽内都近似为100%。

综上,荧光信号的归一化强度可表示为:

(3)

式中:S(λi)为光源光谱归一化辐射强度;Ex(λi)为滤光片组中的激发片光谱透过曲线函数;Q(λi)为荧光染料归一化激发效率也称激发光谱;E(λn)为荧光染料归一化发射效率也称发射光谱;EM(λn)为荧光滤光片发射片光谱透过曲线函数。

激发光源部分反射光会透过发射片进入CCD成像器件,形成背景光信号,即产生背景噪声。最终的背景光信号强度可以表示为:

(4)

其中与反射光辐射强度有关的系数R取104,以保证各项归一化参数计算的辐射强度数量级与式(1)、(2)相吻合。

如果已知光源、滤光片组的光谱曲线以及染料的激发和发射谱线,便可通过式(3)、(4)分别计算出系统后端接收的荧光染料发射的荧光信号强度和背景光强度。将计算得到的强度值进行均匀量化,赋予图像灰度值,最终可得到模拟的荧光图像效果。

荧光成像背景较为均匀,采用Michelson对比度定义[8],分析荧光图像的成像对比度特点,对比度数值可表示为

(5)

式中:c为成像对比度;ΔI=(Imax-Imin)/2;I=Imin。可以看出c是0到1之间的数,可以转换为百分比表示,其值越大,表明信号明暗差异越大,对比越明显。从式(5)可以看出,若图像亮度降低,对比度也相应成比例下降。通过对比度特性可评价系统背景抑制程度,判别滤光片组、光源、染料之间的匹配程度,来指导后续系统设计。

2 仿真分析与结果讨论

首先采用链路模型分析激发光源为激光的情况。由于激光光源单色性较好,成像系统可以不采用激发滤光片,后续成像效果主要由发射滤光片决定,模型计算较为简单。模型中各模块参数如下:激光器中心波长为435 nm,半波带宽为2 nm;滤光片组型号为Chroma© 39001,发射滤光片透过光谱带宽外平均的光密度值为6;荧光试剂为Cerulean。模拟的观测目标由不同的试剂浓度组成,由上到下的目标分别为最大浓度、最大浓度的50%、25%和10%。各模块之间的光谱参数匹配,根据各模块的光谱曲线,采用式(3)、(4)计算信号及背景辐照强度。

根据前面的理论分析,染料浓度最大的目标部位亮度最高,建立的其余目标浓度分别递减,亮度也随之成比例降低。CCD的光圈和曝光时间设置通常以目标高亮处作为参考,避免出现CCD像元过曝或曝光不足的情况。发射滤光片的真实OD值为6,其仿真结果如图2(a)所示。假设发射滤光片在设计时,激发光波长附近的OD值只有4,模拟该种情况下的成像效果。得到的仿真结果如图2(b)所示。进一步降低发射片光密度,使OD值降至3,该情况下的仿真图像如图2(c)所示。

当发射滤光片的光密度值为6时,进入CCD的背景光强度很弱,背景噪声得到了较好的抑制,通过式(5)计算,对比度c为99.79%。从图2(a)可以看到,通过灰度均匀量化后,图像背景灰度值为0,最大浓度处灰度值最高。此种情况下,CCD的灰度区间得到了充分的利用,浓度最大和浓度最小的目标都可以被观察到,灰度图像层次分明。图2(b)所对应的滤光片光密度值为4,相对于前一种情况,更多的背景光能够透过发射片进入到CCD中。图像的背景亮度增大,10%浓度的目标已经被背景光淹没,此时背景噪声已开始对成像产生影响,最亮处的目标还清晰可见,计算得到高亮处对比度为80%。当发射片的OD值降为3时,大量的激发光进入成像光路末端,背景亮度明显增大。图2(c)可以看到,观测目标信号光已完全被背景光所掩盖,系统无法满足工作状态。仿真结果证明,OD值反映了背景信号的截止程度,而背景信号的强度是影响成像对比度效果的因素之一。将不同OD值对应的成像对比度做成关系曲线,如图3所示。

图2 不同OD值下的仿真结果Fig.2 Simulated results under different OD conditions

图3 对比度与OD关系曲线Fig.3 Relationship between contrast and OD

通过图3的曲线关系可以发现,滤光片光密度值在3～5之间时,对比度变化趋势明显;当OD值大于5后,对比度变化趋于平缓。从曲线关系可以看出,继续增加滤光片OD值对于提高成像对比度已无明显作用,反而会增加不必要的设计难度和制造周期。

背景信号截止深度的OD值大于5后,对比度随着OD值增加逐渐平缓,所以成像用滤光片的设计OD值通常在5～7之间。而OD值大于7的滤光片对于微弱信号采集具有重要作用,因此往往用在对探测灵敏度要求更高的其他荧光检测领域[9]。以上分析与实际产品设计和应用是相吻合的,侧面反映出该模型对于背景噪声的仿真具有可行性。

当前荧光成像系统的光源广泛使用LED作为激发光源[10-11],为了能够真实模拟荧光显微镜光源、染料、滤光片组的光谱参数匹配效果,并且能将仿真图像与真实系统进行对照,下面将LED激发光源光谱曲线导入模型作进一步仿真验证。光源采用的是525 nm绿光LED,半宽40 nm,荧光染料及配套滤光片组的光谱曲线如图4所示。

图4 荧光试剂受激发射与滤光片的光谱Fig.4 The spectrum of fluorescence reagent excitation and fluorescence filter

通过各模块归一化光谱曲线,利用式(3)、(4),可模拟出参数匹配下系统的荧光成像效果,结果如图5(a)所示。对于配套的滤光片组,光源、滤光片、荧光染料的光谱曲线匹配较好,能够保证较高的激发光效率和荧光发射强度,图像具有良好的亮度和对比度。滤光片组在膜系设计时,均会考虑激发片与发射片两者的背景交叉点的OD值在6左右,即保证背景的截止深度[2],而往往难以把握的是滤光片组与染料试剂的相互匹配。为了验证滤光片与染料试剂未良好匹配的影响,将滤光片的发射片中心波长由617 nm替换为677 nm,带宽仍为55 nm,模拟该情况下的成像效果,仿真结果如图5(b)所示。与替换前相比,两组的激发片和发射片的背景交叉点均满足OD值在6以上,但是发射片与染料发射光谱未完全匹配。

通过图6仿真结果看到,两种情况的背景噪声都得到了较好的抑制,但图像整体亮度发生了变化。这是由于发射片向长波方向移动后,透过光谱偏离了染料的荧光发射峰,进入到CCD的目标信号强度降低。CCD将接收的荧光信号均匀量化后,图像并未充分利用量化的灰度范围,这是因为图像亮度降低,灰度区间被压缩。这导致图像的灰度层次不再丰富,图像不利于观察,图像对比度会成相应比例下降[12],并且低亮度目标即低浓度区域的细节也会丢失。由此可以发现,荧光图像的对比度不仅和背景强度的抑制程度有关,还与各模块的参数是否匹配息息相关。

为验证仿真图像的可信度,使用荧光显微镜对上述滤光片组进行了实际测试。测试前准备了两套滤光片组,一组光谱曲线参数匹配较好,另一组发射片中心波长向长波偏移60 nm。图6展示了依次替换两组滤光片,分别采集到的组织样本图像。图6(a)为采用与光源和染料匹配的滤光片组,完整呈现了组织轮廓;图6(b)则采用了另一组匹配性不好的滤光片组,组织边缘低染色浓度的区域细节丢失。对比可知,测试中发射片与荧光试剂的发射光谱不完全匹配,会造成CCD采集荧光图像信号衰弱和对比度下降,组织边缘的细节消失。实际系统成像的效果与仿真结果相吻合,证明了该链路模型仿真方法的正确性和有效性。

图5 荧光成像系统仿真图像Fig.5 Simulated images of fluorescence imaging systems

图6 荧光显微镜采集真实图像Fig.6 Images obtained by the fluorescence microscopy

3 结 论

荧光成像系统的设计涉及多个模块,为了缩短产品设计周期并验证各模块参数匹配度,且能更直观地反映系统的成像效果,本文提出了荧光成像链路模型。利用该链路模型,对荧光成像过程进行了分析与仿真,验证了滤光片OD值这一影响对比度主要因素,结论与荧光滤光片设计思路相吻合。另外,荧光成像系统各模块是否良好匹配,也会对图像的对比度和亮度产生影响。本文最后从荧光显微系统入手,通过模型直观仿真了模块不匹配对图像效果的影响,仿真结果与实际成像效果一致,证明该链路模型仿真的可行性和有效性。

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