缬草挥发油的微波辅助提取工艺及其抗氧化活性

李小红，吴地尧，李 安，张静宜，吴德智

（1.贵州理工学院，贵州贵阳550003；2.江西中医药大学，江西南昌330004）

缬草（Valeriana officinalis L.）为败酱科缬草属多年生草本植物，具有镇静、催眠和抗惊厥等神经系统作用，同时具有调节循环系统和抗氧化、抗肿瘤等药理活性［1］。缬草含有挥发油、黄酮类、环烯醚萜类、生物碱类等活性成分，其中挥发油是缬草的主要活性成分。目前，缬草挥发油的提取方法主要是水蒸气蒸馏法，但该方法存在能耗高、提取时间长、提取效率低、挥发油外观与气味发生明显变化等不足。近年来兴起的超临界流体萃取已经应用于缬草挥发油的提取［2］，该方法高效、得油率高、安全环保，但成本较高。目前微波辅助提取技术已广泛应用于挥发油提取［3－6］，该法能在较短时间完成提取，减少了挥发油因长时间高温所造成的含氧化合物热解、水解、氧化等，具有能量利用率高、提取速率快、得率高、可维持挥发油的天然品质等特点［7］。本研究以缬草挥发油提取率为主要指标，通过单因素及Box－Behnken响应曲面试验优化微波辅助水蒸气蒸馏提取工艺条件，并通过还原力、1，1－二苯基－2－三硝基苯肼（简称DPPH）自由基清除力以及羟自由基清除力的测定，与传统水蒸气蒸馏法所得挥发油的抗氧化能力进行比较，以期为缬草的药用和食用产品研究提供基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

缬草根茎，采自贵州省江口县缬草种植基地。正己烷、无水乙醇、铁氰化钾，国药集团化学试剂有限公司；所用其他试剂均为分析纯。

Scientz－IIDM微波光波超声波萃取仪，宁波新芝生物科技股份有限公司；FA1004B电子天平，上海越平科学仪器有限公司；旋转蒸发器，上海上天精密仪器有限公司；UV－2550型紫外－可见分光光度计，梅特勒－托利多国际股份有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 缬草挥发油的提取工艺 采用一般水蒸气蒸馏法对缬草挥发油进行提取。称取适量样品，加一定量NaCl溶液，振摇混合后浸泡一定时间。连接挥发油测定器与回流冷凝管，保持微沸，蒸馏一段时间后停止加热，静置，取挥发油，加无水硫酸钠过夜，过滤得缬草挥发油提取物备用，与微波辅助提取的缬草挥发油进行抗氧化活性的比较。

参照谭承佳等的微波辅助提取挥发油的方法［8］对缬草挥发油进行提取。取适量缬草，将正己烷按一定比例加入圆底烧瓶内，置于改良的微波炉腔内。根据试验要求设定微波功率与时间，回流提取后冷却至室温，抽滤，收集滤液，适量浓缩，水浴蒸干得到微波提取物。再采用上述一般水蒸气蒸馏法收集缬草挥发油，计算挥发油得率：

1.2.2 单因素考察微波辅助提取工艺 本试验针对微波功率（150、300、450、600、750 W）、提取时间（10、15、20、25、30、35 min）、液料比（4 mL∶1 g、6 mL∶1 g、8 mL∶1 g、10 mL∶1 g、12 mL∶1 g）3个因素，保持其中2个变量固定不变，对另1个变量进行单因素试验，以挥发油提取率为指标，以确定Box－Behnken响应曲面设计所需的水平范围。

1.2.3 Box－Behnken响应曲面法优选缬草挥发油提取工艺在单因素试验的基础上，选取微波功率、提取时间、液料比3个对挥发油提取率影响较大的因素，用 Design－Expert 8.0.6提供的Box－Behnken试验，以挥发油提取率为指标优化提取工艺参数，试验设计如表1、表2所示。

表1 Box－Behnken响应面试验因素与水平

表2 缬草挥发油提取的Box－Behnken响应曲面试验设计及评价指标

1.2.4 DPPH自由基清除能力测定 参照 Kim等的方法［9］进行DPPH自由基清除能力的测定。以无水乙醇为溶剂，将挥发油配制成浓度为 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg／mL的溶液备用。精确吸取上述不同浓度的溶液300μL，与2 mL 0004%DPPH溶液充分混合后于室温静置20min，在517 nm处测其吸光度D517nm（1）。以不加提取液的DPPH为空白对照，以维生素C为阳性对照，测定溶液在517 nm处的吸光度D517nm（0）。精确吸取300μL上述不同质量浓度的挥发油溶液，分别与2 mL无水乙醇混合均匀后，以无水乙醇为对照，测定各溶液在517 nm处的吸光度D517nm（2）。用同样的方法对水蒸气蒸馏法提取的挥发油DPPH自由基清除能力进行测定，计算公式如下：

1.2.5 铁氰化钾还原法测定还原力 参照刘水英等的方法［10］对还原力进行测定。配制不同浓度的挥发油样品溶液。取1.5 mL样品，加入1.5 mL pH值6.6的磷酸盐缓冲液和1.5 mL六氰合铁酸钾溶液，混匀后于50℃恒温放置20 min，快速冷却后加入1 mL 10%三氯乙酸溶液，于3 000 r／min离心10 min，取1 mL上清液再加入1 mL蒸馏水和1 mL 0.1%三氯化铁溶液，充分混匀并静置后，于700 nm处测定吸光度，以吸光度表示还原能力，以维生素C为阳性对照。用同样的方法对水蒸气蒸馏法提取的缬草挥发油的还原力进行测定。

1.2.6 羟自由基清除率 参照陈美珍等的方法［11－12］进行羟自由基清除力的测定。配制不同浓度的挥发油样品溶液，取1.5 mL样品，分别加入 1.0 mL 2.5 mmol／L水杨酸溶液、1.0 mL 5 mmol／L FeSO4溶液和 2.0 mL蒸馏水，充分混匀，加入1.0 mL 5 mmol／L H2O2，先置于 37℃恒温水浴锅中反应30 min，再于510 nm处测定其吸光度，以蒸馏水作为空白参比，以维生素C作为阳性对照。用同样的方法对水蒸气蒸馏法提取的缬草挥发油的羟自由基清除率进行测定，具体公式如下：

式中：D510nm（0）为空白对照吸光度；D510nm（2）为加 H2O2样品溶液吸光度；D510nm（1）为不加H2O2样品溶液吸光度。

2 结果与分析

2.1 单因素考察挥发油微波辅助提取工艺

2.1.1 微波功率对挥发油提取率的影响 由图1可知，随着微波功率的增加，挥发油提取率呈现先上升后下降的趋势。当微波功率为300W时，挥发油提取率为（5.27±0.27）%。分析其原因，主要由于当功率升高时，温度过高，低沸点物质随介质沸腾而有所损失。因此，选定150～450 W为响应面设计的最佳水平。

2.1.2 提取时间对挥发油提取率的影响 由图2可知，随着提取时间的增加，挥发油提取率呈先上升后稳定在一定水平再下降的趋势。当提取时间为20～30 min时，提取率稳定在（4.75±0.16）%左右，当继续增加提取时间，挥发油被破坏或从介质挥发从而出现提取率下降的趋势。因此，选定15～30 min为响应面设计的提取时间范围。

2.1.3 液料比对挥发油提取率的影响 由图3可知，随着液料比的增加，挥发油提取率先上升后稳定在一定水平，没有明显提高。当液料比为8 mL∶1 g时，提取率稳定在（5.7±0.25）%左右。主要是因为提取液的增加可使缬草与提取溶剂充分接触，有利于挥发油的浸出。当液料比超过8mL∶1 g时，挥发油的提取基本达到饱和状态。因此，选定（6～10 mL）∶1 g为响应面设计的水平。

2.2 Box－Behnken响应曲面设计优化挥发油微波辅助提取工艺

采用 Design－Expert8.0.6提供的 Box－Behnken试验对各因素进行拟合，得到多元回归方程：

R提取率＝－6.100 5＋0.043 7A＋0.091 4B＋0.832 3C－3.555 5×10－5AB＋2.333 3×10－4AC＋0.020 8BC－6.790 0×10－5A2－4.893 3×10－3B2－0.085 1C2。

对挥发油提取率的回归模型进行方差及显著性分析的结果见表3。可以看出，该模型方程有极显著影响（P＜0.000 1），失拟项不显著（P＝0.061 2＞0.05），说明在本试验条件下，该回归模型所考察的因素足以反映试验中各提取工艺参数对挥发油提取率的影响。R2＝0.988 0＝0.972 5，说明回归模型与试验值拟合均较好，可用于挥发油提取率的理论推测和分析，各因素影响大小依次为微波功率＞提取时间＞液料比。由F检验结果可知，一次项中微波功率、提取时间对挥发油的提取率具有极显著影响（P＜001），交互项中提取时间与液料比之间的交互作用对挥发油提取率具有极显著影响（P＜0.01）；在二次项中微波功率、提取时间、液料比均对挥发油提取率具有极显著影响（P＜001），其他因素之间影响不显著。表3的结果与图4中响应面图反映的各因素间的交互作用吻合。

表3 试验结果方差分析

由Design－Expert8.0.6软件得出，挥发油提取的最佳工艺参数是微波功率326.30 W、提取时间25.48 min、液料比8.57 mL∶1 g，在此条件下挥发油的提取率为5.89%。为便于生产试验需求，设定微波功率为330 W，提取时间为25 min，液料比为8.6 mL∶1 g，进一步进行验证试验，得出挥发油提取率为（5.92±0.07）%。该值与预测值比较近，因此选取微波功率330W、提取时间25 min、液料比8.6 mL∶1 g作为微波辅助提取缬草挥发油的工艺参数。

2.3 不同提取工艺提取的缬草挥发油抗氧化活性

2.3.1 DPPH自由基清除能力测定结果 由图5可知，水蒸气蒸馏法与微波辅助提取法得到的缬草挥发油对DPPH自由基均有较强的清除能力，且缬草挥发油浓度与DPPH清除率存在正相关关系，微波辅助提取的清除能力明显高于一般水蒸气蒸馏法。当缬草挥发油浓度为0.5 mg／mL时，微波辅助提取法的清除率为80.9%，而水蒸气蒸馏法的清除率为70.2%。

2.3.2 还原力测定结果 吸光度与样品的还原力具有正相关关系，吸光度越大，样品的还原力越强。由图6可知，水蒸气蒸馏法与微波辅助提取法得到的缬草挥发油均具有较强的还原能力，说明该缬草挥发油也具有较强的抗氧化能力。在测定的质量浓度范围内，缬草挥发油的还原力随着浓度的升高而增强，且微波辅助提取的缬草挥发油还原力明显高于一般水蒸气蒸馏法。当缬草挥发油浓度为0.5 mg／mL时，微波辅助提取法的吸光度为1.35。

2.3.3 羟自由基清除率 由图7可知，水蒸气蒸馏法与微波辅助提取法得到的缬草挥发油对羟自由基均有较强的清除能力，随着挥发油浓度的增加，清除率也随之提高，微波辅助提取的清除能力明显高于一般水蒸气蒸馏法。当缬草挥发油浓度为0.5 mg／mL时，微波辅助提取法的清除率为78.9%，而水蒸气蒸馏法的清除率为73.1%。

3 结论

响应面法已广泛应用于化工、食品、农林、冶金等各领域，具有试验次数少、设计简便等优点。本研究以缬草为主要原料，采用Box－Behnken响应曲面设计，对其挥发油微波辅助提取工艺条件进行优化，并对微波辅助提取的挥发油与一般水蒸气蒸馏得到的挥发油进行抗氧化性能研究。结果表明，微波辅助提取挥发油的最佳工艺条件为微波功率330 W、提取时间25 min、液料比8.6 mL∶1 g，此条件下提取的缬草挥发油得率为（5.92±0.07）%。本试验挥发油提取工艺稳定可行，提取率高，具有较强的还原能力，对DPPH自由基、羟自由基均有较强的清除能力，抗氧化能力与一般水蒸气蒸馏法相比具有显著差异。微波辅助提取是一种节能、高效、提取植物高品质挥发油的新技术，在植物开发及食品研究中具有很好的应用前景。

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