氟磺胺草醚抑制大豆根瘤固氮酶活性与碳代谢关系的研究

纪广影，丁 伟，高文逸，赵慧凝

（东北农业大学农学院植保系，黑龙江哈尔滨150030）

大豆是我国重要的粮食作物之一［1］。大豆不同于其他非豆科植物的显著特点是，土壤中的根瘤菌侵染根表皮细胞形成根瘤，将空气中的N2逐步转化为NH3并吸收利用进而完成蛋白质合成。大豆根瘤的共生固氮作用为大豆生长提供了重要的氮素来源，对大豆产量和品质提高具有非常重要的作用［2］。氟磺胺草醚是目前国内大豆生产中最常用的除草剂之一，具有选择性，主要用于旱田除草，在花生、大豆田中防除阔叶杂草极为有效。目前，关于除草剂对根瘤固氮影响的研究结果表明，除草剂可以破坏土壤微生物的生长环境，抑制根瘤的生长发育、结瘤及固氮能力［3－4］；除草剂抑制碳代谢，导致同化产物合成和运输受到障碍，从而影响根瘤能量供应［5－7］。国内的研究多集中在除草剂对根际环境、根瘤菌及根瘤生长发育的影响；国外的研究多侧重于除草剂对根瘤固氮酶活性的影响，酰胺类除草剂异丙草胺和有机磷类除草剂草甘膦对根瘤固氮酶活性均有显著的抑制作用［5，8－9］。关于氟磺胺草醚对大豆根瘤固氮影响的研究较少，但氟磺胺草醚仍是我国大豆生产中常用的除草剂之一。根瘤固氮作用在根瘤的类菌体中进行，这一化学反应需要光合作用合成的碳水化合物作为能源。本试验以氟磺胺草醚对大豆光合碳代谢影响为切入点，研究不同剂量氟磺胺草醚对大豆叶片光合速率、根瘤细胞浆蔗糖含量、根瘤蔗糖合成酶活性的影响，及其与固氮酶活性的相关性，从而揭示氟磺胺草醚抑制大豆根瘤固氮活性的生理机制，以期为正确评价氟磺胺草醚对大豆的安全性提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计

试验在东北农业大学校内试验基地进行，供试大豆品种为东农50，供试除草剂为250 g／L氟磺胺草醚水剂。试验共设2个处理，氟磺胺草醚施用剂量分别为337、675 g a.i.／hm2，并以未施氟磺胺草醚的处理作空白对照，每个处理4次重复。大豆于2016年5月2日播种，在大豆第3张复叶完全展开时，用250 g／L氟磺胺草醚水剂对茎叶进行处理。分别于施药7、14、21、28 d后取样，每个小区挖取10～15株大豆完整根系，带回实验室测定相关指标。

1.2 测定方法

1.2.1 光合速率的测定 采用美国产Li－6400XT便携式光合速率测定仪测定大豆叶片光合速率。叶室CO2浓度设定为 400μmol／CO2mol，温度为 22.5℃，空气相对湿度为40% ～50%。施药7、14、21、28 d后，在晴天 09：00—11：00，于每个处理小区中间2行随机选3株大豆的相同部位测定完全展开叶片的光合速率。

1.2.2 固氮酶活性的测定 参照ZabLotowicz等的方法并经过改进，利用日本岛津GC－14C气相色谱分析仪，采用乙炔还原法活体测定固氮酶活性［10－11］。取2根完整的大豆根系放入具塞血清瓶中，用橡皮塞封闭，先用注射器从瓶中抽出5.0 mL空气，再向瓶中注入5.0mL乙炔气体，28℃反应2 h，反应结束后，用微量进样器分别抽取1.0mL反应瓶中的混合气体，注入气相色谱仪测定乙烯含量。

气相色谱柱为长2 m的不锈钢填充柱，固定相为GDX－502，氢火焰离子检测器，柱温为65℃，检测室温度为110℃，气化室温度为110℃；用N2做载气，流量为35 mL／min；燃气（H2）压力为 0.8 kg／cm2，空气压力为 1.6 kg／cm2。

1.2.3 大豆根瘤细胞浆中蔗糖含量的测定 将大豆根瘤中心的类菌体去掉，剩余部分即为细胞浆，采用张志良等的间苯二酚比色法测定细胞浆内的蔗糖含量［12］。

1.2.4 大豆根瘤蔗糖合成酶活性测定 粗酶液提取：取约1 g预冷样品，加入3 mL提取介质（100 mmol pH值为7.2的Tris－HCl、10 mmol MgCl2、1 mmol乙二胺四乙酸二钠、10 mmol疏基乙醇、2%乙二醇、1%交联聚乙烯吡咯烷酮，各0.5 mL）于研钵中快速研磨成均匀糊状后，再用2 mL提取介质清洗研钵2次，倒入离心管中，12 000 r／min低温冷冻高速离心机离心10 min。取上清液测定蔗糖合成酶合成方向的活性，以上过程均在4℃下进行。

蔗糖合成酶分解方向活性的测定：每个处理取4只试管，各加入0.2 mL粗酶液（对照加入 0.2 mL 2 mol／L NaOH），加0.6 mL分解反应介质（100 mmol pH值为7.2的 Tris－HCl、10 mmol MgCl2、5 mmol尿苷二磷酸葡萄糖、50 mmol蔗糖，各0.15 mL），在 30℃水浴 30 min后，再沸水浴 5 min，加入0.2 mL 2mol／LNaOH混匀，再加入0.5mL 3，5－二硝基水杨酸在沸水中加热5 min，冷却，再加入4 mL蒸馏水，在540 nm处比色［13］。

1.3 数据分析和计算

用Excel对试验数据进行整理，用SPSS 17.0软件对试验数据进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 氟磺胺草醚对固氮酶活性的影响

由图1可知，在施药的28 d内，氟磺胺草醚对根瘤固氮酶活性一直有抑制作用。337、675 g a.i.／hm2氟磺胺草醚对固氮酶活性的抑制率分别达12.42%～15.61%、18.30%～28.28%。337 g a.i.／hm2氟磺胺草醚在处理 21 d后时抑制率达到最高值，之后减小；675 g a.i.／hm2氟磺胺草醚在处理14 d后时抑制作用最强，在28 d后时抑制作用最弱。且高剂量处理下的抑制作用大于低剂量。

2.2 对光合速率的影响

2.2.1 氟磺胺草醚对光合速率的影响 由图2可知，施用不同剂量的氟磺胺草醚后，对光合速率的抑制作用明显，337 g a.i.／hm2氟磺胺草醚对光合速率的抑制率最高值达16.89%，675 g a.i.／hm2氟磺胺草醚对光合速率的抑制率最高值为20.19%，且都出现在施药21 d后时，之后抑制作用减弱，光合速率恢复正常。

2.2.2 氟磺胺草醚对根瘤固氮酶活性影响与光合速率的关系 由图3、图4可知，2个剂量的氟磺胺草醚处理下，根瘤固氮酶活性与叶片光合速率在测定的时间点均呈正相关，分别在14、21 d后及21、28 d后呈显著正相关，表明根瘤固氮酶活性高低与光合速率显著相关。

2.3 对蔗糖含量的影响

2.3.1 氟磺胺草醚对根瘤细胞浆中蔗糖含量的影响 由图5可知，施用氟磺胺草醚后，根瘤细胞浆中蔗糖含量与对照相比，均受到不同程度的抑制，337 g a.i.／hm2氟磺胺草醚在处理 14 d后时的抑制率最高，为 30.95%，675 g a.i.／hm2氟磺胺草醚在处理7 d后时的抑制率最高，为36.29%。且随着施药时间的延长，抑制作用逐渐减弱，蔗糖含量恢复正常。

2.3.2 氟磺胺草醚对根瘤固氮酶活性影响与根瘤细胞浆中蔗糖含量关系 由图6、图7可知，不同处理下固氮酶活性与根瘤细胞浆中蔗糖含量之间呈正相关；施用 675 g a.i.／hm2氟磺胺草醚时，在28 d后固氮酶活性与根瘤细胞浆中蔗糖含量之间呈显著正相关，说明固氮酶活性与根瘤浆细胞中蔗糖的含量存在一定的相关关系。

2.4 对蔗糖合成酶的影响

2.4.1 氟磺胺草醚对根瘤蔗糖合成酶活性的影响 由图8可知，在 337、675 g a.i.／hm2用量下，氟磺胺草醚对根瘤蔗糖合成酶活性的抑制率分别在21、14 d后时达到最高值，分别为33.08%、39.94%，随着施药时间的延长，抑制率逐渐减小，根瘤蔗糖合成酶活性逐渐恢复到正常水平，但高剂量处理下的抑制作用时间较长，恢复较慢。

2.4.2 氟磺胺草醚对根瘤固氮酶活性影响与根瘤蔗糖合成酶活性关系 由图9、图10可知，施用337 g a.i.／hm2氟磺胺草醚7、21 d后，固氮酶活性与根瘤蔗糖合成酶活性呈显著正相关；施用675 g a.i.／hm2氟磺胺草醚，在测定的28 d内固氮酶活性与根瘤蔗糖合成酶活性均呈显著正相关。

3 结论与讨论

氟磺胺草醚的作用靶标是植物体内原卟啉原氧化酶，原卟啉原氧化酶固定于叶绿体内，是催化叶绿素与亚铁原卟啉生物合成最后阶段的酶，此种酶被抑制可造成对光敏感的原卟啉原IX迅速积累［14］，在光合分子氧存在的条件下原卟啉原Ⅸ产生单态氧，使脂膜过氧化最终造成细胞死亡。氟磺胺草醚施药1～3 d后，叶片有明显的坏死斑点等药害症状，说明叶片的光合作用受到影响［15］。

以碳的同化为核心的光合作用是植物生长发育过程中最基本的物质和能量来源，是碳代谢中的重要部分［16］。蔗糖是高等植物光合作用的主要产物，又是叶片光合产物向各器官运输的主要形式［17］，而蔗糖合成酶既可以催化蔗糖的合成也可以催化蔗糖的分解，对植物体内蔗糖的代谢起着至关重要的作用，代表着植物碳代谢的水平［18］。根瘤中的固氮作用在类菌体中进行，类菌体利用光合产物蔗糖呼吸作用产生电子及能量腺嘌呤核苷三磷酸，从而把还原成＋［19］。

氟磺胺草醚对根瘤细胞浆蔗糖含量的抑制作用在14 d后时最强，此时固氮酶活性明显降低。施药28 d后时，氟磺胺草醚对根瘤蔗糖合成酶活性的抑制作用最弱，与对照相比，细胞浆蔗糖含量无明显差异。光合速率的高低也影响着固氮酶活性。同时发现，在高剂量（675 g a.i.／hm2）氟磺胺草醚处理下，各项指标受到的抑制作用更强且持续时间较长，正常剂量（337 g a.i.／hm2）氟磺胺草醚处理下根瘤固氮和碳代谢受到影响的程度要轻于高剂量，且之后可恢复正常水平。

本研究中，在氟磺胺草醚处理后，固氮酶活性与叶片光合速率呈显著正相关，高剂量氟磺胺草醚处理下根瘤细胞浆蔗糖含量在28 d后与根瘤固氮酶活性呈显著正相关，且氟磺胺草醚与根瘤蔗糖合成酶活性也呈显著正相关。结果表明，固氮酶活性的变化受到叶片光合速率、根瘤细胞浆蔗糖含量及根瘤蔗糖合成酶活性的影响，大豆光合作用受到抑制，产生的能量减少，从而使根瘤细胞浆内的蔗糖含量减少，根瘤蔗糖合成酶活性受到抑制，导致大豆根瘤固氮时可以利用的能源与碳源减少，根瘤固氮酶活性受到抑制。

施用氟磺胺草醚后，叶片光合速率、根瘤细胞浆中的蔗糖含量、根瘤根瘤蔗糖合成酶活性均与根瘤固氮酶活性呈正相关。碳代谢受到抑制，同化产物供应不足是氟磺胺草醚抑制固氮酶活性的重要原因。正常剂量的氟磺胺草醚对根瘤固氮和碳代谢有短时间的不利影响，后期可恢复。

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