郑麦9023胚性悬浮细胞系的建立和植株再生

李冬兵, 吕桂珍, 牛洪斌, 尹 钧*

(1.河南农业大学，河南粮食作物协同创新中心/小麦玉米作物学国家重点实验室/国家小麦工程技术研究中心，河南郑州 450002; 2.华南师范大学 生命科学学院，广东省高校生态学与环境科学重点实验室，广东 广州 510631)

悬浮细胞系是研究细胞周期及细胞代谢影响因素的一种方便的工具[1-2]。悬浮细胞系的研究一直是植物研究的热点领域之一，原因在于悬浮细胞系可以用来建立植物高效稳定的遗传转化体系及进行体细胞无性系突变体的筛选。与双子叶植物相比，单子叶植物的胚性悬浮系更难建立[3]。悬浮系的建立受基因型、外植体及培养基的组成等因素的影响[4]。对于双子叶植物，胚性愈伤组织则可以从茎尖或叶片中获得。用于小麦胚性悬浮系建立的愈伤组织可通过花药、幼胚等外植体诱导产生[5]。目前有2种获得小麦悬浮系的方法[6]。一种是通过胚性愈伤组织直接获得悬浮系；第二种是先诱导产生愈伤组织，然后通过继代培养，挑选出胚性愈伤组织后，进而制备悬浮系[7]。因为涉及到组织的分化，这2种方法操作起来都很耗时。

稳定的细胞悬浮系再生能力长达10个月之久[5,8]。到目前为止，仅有部分栽培种进行了小麦悬浮细胞系的建立试验，且效果都不好。笔者所在课题组研究方向是小麦逆境分子调控，而以转基因育种为代表的小麦分子育种为解决小麦的抗逆问题提供了一个崭新的方向。

高效稳定的遗传转化体系的建立是小麦转基因分子育种的瓶颈之一。本研究以小麦郑麦9023作为研究对象，建立并优化胚性悬浮细胞系，完成胚性悬浮系植株再生的过程，旨在为小麦高效遗传转化体系的建立提供有效的技术支撑。

1 材料和方法

1.1 材料

小麦郑麦9023，来源于河南农业大学国家小麦工程技术研究中心小麦生长发育分子调控实验室。

1.2 方法

将未成熟的小麦郑麦9023种子置于4 ℃冰箱内保存24～48 h，在超净工作台内，将穗子用70%乙醇消毒1 min，0.1%升汞消毒8 min，用灭菌过的蒸馏水冲洗5遍，用解剖刀片挑取幼胚。

1.2.1 诱导产生愈伤组织 制备含不同2，4-D质量浓度的MS诱导培养基，将上述操作过的幼胚置于不同的培养基上诱导愈伤组织。每皿放30粒幼胚，Parafilm封口。28 ℃条件下黑暗培养25 d后，统计各个不同浓度培养基上愈伤组织的诱导情况。

1.2.2 胚性愈伤组织的继代培养 制备含2，4-D和KT不同质量浓度组合的MS继代培养基，从1.2.1得到的愈伤组织里挑取胚性愈伤组织(通常是浅黄致密的)，转移至到不同质量浓度的继代培养基上，28 ℃(16 h光照/8 h黑暗)培养20 d，观察所得愈伤组织的生长情况。按照同样的操作进行愈伤组织在固体培养基上的继代培养。

1.2.3 悬浮细胞系的建立 将生长状态较好的愈伤组织(胚性愈伤组织通常是黄色颗粒状的)转入150 mL三角瓶中进行悬浮培养，添加75 mL液体培养基，置摇床上培养，转速120 r/min，培养温度(26±2)℃，光照强度1 000 μmol/(m2·s)，每20 d进行1次继代。

1.2.4 悬浮细胞系的参数测定 鲜质量、悬浮细胞系液体培养基pH值的测定参考陈琰等[9]的方法。

1.2.5 植株再生与移栽 将悬浮系当中的成熟胚转移至基本的MS固体培养基上，记录其发育情况，统计最终的移栽成活率。

2 结果与分析

2.1 不同质量浓度2，4-D对郑麦9023幼胚诱导愈伤组织的影响

表1显示，郑麦9023幼胚在2，4-D质量浓度为3.0 mg/L时出愈率达到最大值。在较低的2，4-D 质量浓度范围内(1.0～3.0 mg/L)，郑麦9023幼胚的出愈率随2，4-D质量浓度的升高而增大；然而，在较高的2，4-D质量浓度范围内(3.0～5.0 mg/L)，郑麦9023幼胚的愈伤诱导率随2，4-D质量浓度的增加而降低。较高2，4-D质量浓度范围内(3.0～5.0 mg/L)的愈伤组织的状态不好，不容易挑选胚性愈伤组织。因此，综合愈伤组织诱导率及后期愈伤组织继代情况考虑，郑麦9023幼胚最佳的愈伤组织诱导培养基为含有2，4-D质量浓度为 3.0 mg/L的MS培养基。

表1 不同质量浓度2，4-D对郑麦9023幼胚愈伤组织诱导的影响

2.2 不同质量浓度的2，4-D、 KT对愈伤组织继代的影响

将郑麦9023幼胚诱导得到的愈伤组织转移至含有2，4-D和 KT不同质量浓度组合的MS培养基上进行继代培养。对所得到的愈伤组织进行了形态学观察，表2结果显示，当2，4-D的质量浓度为1.0 mg/L时，低质量浓度KT处理就可以获得生长状态良好的愈伤组织，而随着KT质量浓度的增加，愈伤组织的状态趋向褐化。比较可得，最适宜进行小麦愈伤组织继代的培养基是MS+ 1.0 mg/L 2，4-D + 0.1 mg/L KT，该继代条件下可以得到胚性愈伤组织(即黄色松脆型)。

表2 不同质量浓度的2，4-D和KT对郑麦9023幼胚愈伤组织继代的影响

2.3 郑麦9023 胚性细胞悬浮系最佳pH值的确定

在细胞进行悬浮培养时，培养液的pH值不断发生变化。测定结果显示(图1)，在细胞悬浮培养的前8 d，pH值急剧下降，由6.0降至4.6，随之又逐渐上升；随着细胞生长速度的减缓，pH值的上升速度也逐渐减缓，在16 d后渐趋稳定，保持在5.8左右。

图1 不同培养天数悬浮液pH值的变化

2.4 郑麦9023胚性细胞悬浮系继代最佳周期的确定

在细胞悬浮培养过程中，细胞的生长量在不断发生变化，但是会出现一个最大值。测定结果显示(图2)，在细胞悬浮培养的最开始的8 d里，细胞呈现缓慢生长；8～16 d细胞快速增长；16 d以后细胞基本不再生长，生长量保持在0.5 g左右。综合细胞的生长量及悬浮系pH值的变化可以确定悬浮系的最佳继代时间为16 d。

图2 不同培养天数悬浮液中细胞生长量的变化

2.5 郑麦9023胚性细胞悬浮系的建立

将继代产生的胚性愈伤组织转移至含有1.0 mg/L 2，4-D 和 0.1 mg/L KT的 MS液体培养基上进行悬浮培养(图3A)，通过调整悬浮培养体系的pH值及继代周期，获得了状态良好的悬浮培养细胞。这些胚性悬浮细胞在悬浮系中稳定培养一段时间后会进入到体细胞胚胎发生的途径，由图3B和3C可以看出悬浮细胞所处的时期是盾型胚。

图3 悬浮细胞的状态

2.6 植株再生与移栽

单子叶植物的体细胞胚胎发生包含原胚、球形胚、盾型胚等不同的发育阶段。本研究将所得的盾型胚转移至基本的MS固体培养基上，茎端先发育，然后开始长根。如图4所示，最终长成正常的植株，检测发现植株的移栽成活率达到95%。

3 结论与讨论

有关利用愈伤组织、悬浮细胞及原生质体进行小麦的组织培养及再生的报道很多，这些研究都需要愈伤组织。有研究者想通过直接挑选胚性愈伤组织进入到悬浮阶段，而省去先诱导愈伤组织再得到胚性愈伤组织这一步骤，然而仅在部分基因型中得到实现。胚性愈伤组织是可以从悬浮细胞中直接获得的。

图4 郑麦9023成熟胚发育成正常的植株

植物愈伤组织诱导以及继代培养受到多种因素的影响，如基因型、外植体、培养基、植物生长调节剂、温度等，其中植物生长调节剂影响很大。很多研究表明，用于愈伤组织诱导的最佳培养基中2，4-D的质量浓度为2.0 mg/L[10]，然而在本试验中，小麦郑麦9023愈伤组织的最佳诱导培养基中2，4-D的质量浓度为 3.0 mg/L，基因型的不同可能导致了试验结果的差异。

本试验的愈伤组织固体继代培养基中，所选择的2，4-D质量浓度为1.0～3.0 mg/L。结果显示，在低质量浓度的2，4-D下，愈伤组织在继代培养过程中生长状态较好，而在高质量浓度2，4-D下，愈伤组织在继代培养过程中状态不好。同时附加了不同质量浓度的KT，最终在MS+ 1.0 mg/L 2, 4-D + 0.1 mg/L KT的最佳培养基上得到了黄色松脆的胚性愈伤组织，进而继续探索最佳的悬浮体系。

与固体培养相比，细胞悬浮培养具有细胞繁殖速度快，能大规模地培养和提供大量均匀一致的植物细胞培养物的特点[11-14]。本试验中，液体培养的悬浮细胞分裂速度快，球形胚的数量多且较同步，并可以得到较多的各个时期的胚。球形胚经过体胚萌发和体胚成熟等步骤的处理，成功地诱导获得了体胚的再生植株。

相对于器官发生而言，体细胞胚胎发生的优点很多，包括高效、再生效率高等,适合于在分子水平上研究胚胎发生[12]；体细胞胚胎发生系统是遗传转化研究的良好受体系统，利用农杆菌介导的转化方法，可以转入有用抗性基因，进行遗传改良研究[12]。

基于小麦的胚性细胞悬浮系可以有效开展小麦的细胞工程研究，包括小麦体细胞无性系突变体的筛选、生物反应器等。目前，大多数的小麦突变体还是通过EMS诱变获得，与EMS诱变相比，体细胞无性系突变体具有快速获得、遗传稳定性高等优点。

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