硫氧化菌在再生水环境中对水泥材料的腐蚀研究

李静静 ，卢静芳 ，杨 帆 ，苑宏英 ，张少峰 ，王天赐

（1.天津城建大学a.环境与市政工程学院；b.天津市水质科学与技术重点实验室，天津 300384；2.天津农学院 工程技术学院，天津 300384）

再生水是指废水或雨水经适当处理后，达到一定的水质指标，满足某种使用要求，可以进行有益使用的水.目前世界上水资源短缺，再生水的合理利用既可以解决水资源短缺问题，又可以减少环境污染，是国际公认的“第二水源”，是解决目前城市缺水问题的有效途径之一[1].

再生水在输配过程中，管道的微生物腐蚀问题普遍存在，严重影响再生水水质的安全输送，已成为一个必须正视的现实问题.据报导，70年代德国汉堡市的废水系统混凝土管道由于硫氧化细菌引起的腐蚀而造成的维修费用至少达到5 000万马克，在美国也同样造成年损失约为1亿美元[2].有学者通过分析混凝土污水管道腐蚀破坏的过程和特征，提出微生物腐蚀作用机理：硫氧化菌能够利用单质硫和还原态的硫化物，产生生物硫酸，与碱性的水泥材料反应，导致水泥水化产物水化硅酸钙（CSH）分解；并与氢氧化钙反应生成石膏，进而导致钙矾石的形成，使水泥材料发生崩解，水泥材料被腐蚀，成分流失影响水质的安全输送[3-4].但是，目前关于硫氧化菌在再生水中对水泥材料腐蚀问题的研究还不是很完善.本实验选用典型腐蚀菌那不勒斯硫杆菌为研究对象，研究其生理生化特征及在再生水中的生长情况，同时，探讨其对水泥材质的腐蚀情况，以期对再生水输送过程中的水质安全及管道防腐工作提供理论依据与技术支持.

1 实验材料与方法

1.1 再生水和水泥材料

实验采用的再生水取自天津市某再生水厂，水泥材料是参考铸铁管壁水泥砂浆内衬性能要求的相关标准《给水管线用球墨铸铁管、管件、附件及接头的要求与试验方法》和《球墨铸铁管和管件水泥砂浆内衬》等制作而成的水泥砂浆试片（尺寸：40mm×40 mm×10 mm）.水泥试块制作用水为实验室自来水，水泥为42.5号水泥，矿渣粉采用S95级别，河沙粒径在2 mm以下.水泥试块经抗压抗折强度测试均符合ISO 16132—2004《球墨铸铁管及管件水泥砂浆内衬密封层》标准后，将其制作成水泥试片完全浸没于接种有8%硫氧化菌的再生水中，定时取样检测水泥材料的腐蚀情况[5].

1.2 硫氧化菌及其培养基

本实验选用Halothiobacillus neapolitanus为实验用菌种，该纯菌种符合ATCC标准.菌种临使用时，在无菌条件下用已灭菌的ATCC290液体培养基对粉末状菌种进行溶解，并进行扩大培养.采用培养3代的菌液投加到再生水中进行水泥材料的腐蚀研究.本实验ATCC290培养基配方见表1.

1.3 硫氧化菌的生理生化特征

1.3.1 硫氧化菌的菌落与形态观察

将菌种分离培养后，用接种环挑取一环单菌落于载玻片上，将其固定，进行革兰氏染色.具体步骤为：初染，用结晶紫染色液滴于涂片上染色1 min，水洗；媒染，用碘液媒染1 min，水洗；脱色，用95%酒精冲洗20～30 s，脱去染液后，水洗；复染，滴加沙黄于涂片上30s，水洗，用吸水纸吸干或者自然晾干，并用LEICA DFC290 HD型号显微镜油镜（×100）观察其形态特征[6].

表1 那不勒斯硫杆菌ATCC290培养基配方

1.3.2 硫氧化菌在培养基中的生长曲线的测定

取相同接种量的菌液接种到新鲜的培养基中，于30℃，170 r/min条件下，在天津市欧诺仪器仪表有限公司制造的HNY-型号的恒温培养振荡器中进行培养，并定期在无菌条件下取出菌液.采用PE UV/Vis Lambda35紫外分光光度计在600 nm下测定吸光度值OD600，绘制培养基中硫氧化菌的生长曲线.

1.4 硫氧化菌在再生水中的生长情况

分别接种5%、8%、12%、15%的硫氧化菌菌液到再生水中，在30℃，170 r/min的条件下，于恒温培养振荡器中进行培养，步骤同1.3.2.定期用紫外分光光度计测定OD600，用哈希便携式pH计测定pH值.观测不同接种量的菌液在再生水中生长的情况.

1.5 再生水中硫氧化菌代谢产物的测定

在再生水系统中，微生物不断繁殖和生长，会分泌于细胞外的一些高分子黏性聚合物，为胞外聚合物（EPS）.不同基质条件会对其产生不同的影响.它能够紧密附着在管道内壁，EPS的黏性使得它能够黏附有机物和微生物形成生物膜，生物膜聚集到一定程度会在水力冲刷等因素下脱落，会导致再生水中的多数悬浮细菌，进而对管网水质产生不利影响，使得管道腐蚀加剧，输水能力降低等.胞外聚合物中蛋白质和多糖含量较高，约占EPS含量的70%～90%，也含有少量的腐殖质、核酸、糖醛酸、脂类和氨基酸等物质[6].本实验采用阳离子交换树脂（CER）对硫氧化菌胞外代谢产物进行提取，具体操作步骤：以12.5 g CER/g生物膜投加量将CER加入到生物膜样品中；在4℃摇床中，200 r/min搅拌2 h，取出混合物放置在Centrifuge 5430R型号的高速冷冻离心机里；首先在20 000转，4℃条件下离心20 min，然后在10 000转，4℃条件下离心15 min；上清液用0.22 μm滤膜过滤，过滤后液体于4℃保存待测.用Folin-酚法和蒽酮法在PE UV/Vis Lambda35紫外分光光度计上对蛋白质和多糖的含量进行测定[7].

1.6 水泥砂浆试片的腐蚀程度测定

硫氧化菌及其代谢产物，如硫酸与水泥中某些成分发生反应会生成膨胀性物质钙矾石和石膏，破坏了水泥材料的结构，并产生裂缝进一步加剧腐蚀作用.水泥中的成分会随着水流作用流失到再生水中，导致水泥片失重[8-9].本实验将水泥砂浆试片浸没在硫氧化菌接种量为8%的再生水中，运行一段时间后，从系统中取出水泥砂浆试片，先用去离子水将其表面冲洗干净，再用无水乙醇浸泡1 d，去除试片表面可能具有的微生物.然后用干燥清洁的滤纸包裹水泥试片于干燥箱中（25℃）干燥至恒重，最后用天平称重，并与原始水泥试片（测定步骤同上）数据进行对比，通过测定水泥片的失重量和失重率，以表征水泥材料受腐蚀情况.

2 结果与讨论

2.1 硫氧化菌的形态观察

硫氧化菌菌落形态为不透明的乳白色圆形菌落，边缘整齐，中间稍有隆起，表面光滑有光泽，约0.5～1 mm大小.革兰氏染色结果为革兰氏阴性菌，油镜观察该硫氧化菌为短杆状，大小约为0.5～1 μm.菌落及显微镜观察形态如图1所示.

图1 硫氧化菌菌落形态及革兰氏染色结果

2.2 硫氧化菌在培养基中的生长曲线

硫氧化菌接种至培养基中之后，首先有一段时间的适应期，实验结果显示：适应期约为0～12 h；12～14 h开始进入对数期，约为14～40 h，此阶段细菌大量生长；40 h之后进入了稳定期，稳定期细菌保持一定的浓度，变化缓慢；72 h后缓慢进入衰亡期，细菌数量开始下降，如图2所示.

图2 硫氧化菌在ATCC290培养基中的生长曲线

2.3 不同接种量的硫氧化菌在再生水中的生长情况

那不勒斯硫杆菌以不同的接种量接种到再生水中的生长情况如图3所示.图中可知该硫氧化菌生长为四个时期，适应期，对数期，稳定期和衰亡期.硫氧化菌接种量为5%和8%时总体比12%和15%的细菌浓度大，适应期为0～14 h，比12%和15%的0～24 h要短.分析原因可能为再生水中的可供该硫氧化菌生长的营养物质有限，接种量大时，菌种之间存在竞争关系，表现为硫氧化菌浓度反而比小接种量的浓度要小.接种量为8%时，硫氧化菌总体生长情况最佳，细菌浓度达到最大，OD600为0.04.考虑到硫氧化菌的生长情况，最适宜的接种量为8%.

图3 不同接种量的硫氧化菌的生长曲线

硫氧化菌在再生水中的生长过程中，再生水pH值的检测结果为随着时间的延长呈下降趋势，并逐渐趋于平缓，如图4所示.硫氧化菌接种量为8%时再生水的pH值较接种量为5%的低，且pH降低的速率更大，在158 h达到最低值6.95.这说明其产酸能力更强，硫氧化菌把再生水中硫单质及硫还原态物等物质氧化，而产生生物硫酸，使得pH值降低.硫氧化菌接种量为5%时，生长到158 h再生水pH值降低到最低值7.67，总体降低趋势较为平缓，推测原因为后期硫氧化菌处于衰亡期，营养物质逐渐缺乏，且大量细胞死亡破裂导致[10].

图4 不同硫氧化菌接种量的再生水pH变化

2.4 硫氧化菌在再生水中的胞外代谢产物

本实验采用阳离子交换树脂对EPS进行提取，其中蛋白质和多糖含量较高.结果显示：硫氧化菌为接种量8%时的蛋白质和多糖的含量均高于5%，其蛋白质含量为653 mg/L，多糖的含量为6.89 mg/L；硫氧化菌接种8%到再生水中生长产生的胞外代谢产物量更大，推断其对再生水水质及水泥材料的影响更大，如图5所示.从图中可知DNA相对于蛋白质和多糖含量均比较小，不同接种量的DNA值分别为0.07 mg/L和0.06 mg/L，说明采用阳离子交换树脂提取胞外聚合物时细菌细胞的破裂程度较低.

图5 提取的代谢产物中蛋白质、多糖和DNA含量

2.5 硫氧化菌对水泥砂浆试片的腐蚀

水泥砂浆试片的失重量和失重率均随着时间先增大后减小（见图6），失重量最大值达到0.23，失重率为0.01.实验进行前两个月，水泥材料失重量和失重率增大.分析原因为水泥材料遭到腐蚀，再生水中的化学物质、那不勒斯硫杆菌的生理生化活动及产生的代谢产物等使水泥材料发生化学反应产生钙矾石等物质，破坏了水泥结构，进而产生一些裂缝，使得水泥里面的成分流失等导致.实验后期，水泥材料失重量和失重率减小（见图6），水泥砂浆试片表面堆积有大量的生物膜（见图7）.分析原因为水泥材料发生化学反应，形成一层化学物质，以及表面附着一层生物膜，阻止再生水中其他成分进入水泥试片内部，使得水泥砂浆试片的腐蚀速率有所减缓.

图6 水泥材料的失重率和失重量

图7 3月后的水泥砂浆试片形貌

3 结论

（1）硫氧化菌在再生水中接种量为8%时，生长状况最佳，将再生水pH值降低至酸性，对碱性的水泥材料影响很大.

（2）比较不同硫氧化菌接种量，8%时产生的胞外代谢产物含量最高，其中蛋白质含量达到653 mg/L，多糖的含量为6.89 mg/L.

（3）水泥材料在接种有8%硫氧化菌的再生水中受到了腐蚀，水泥砂浆试片失重，水泥材料受腐蚀程度先增大后减小.

参考文献：

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