基于ITS序列对辛夷及其混伪品种的鉴别

高宝云，赵月梅

(商洛学院 生物医药与食品工程学院，陕西 商洛726000)

中药辛夷来源于木兰科植物望春花(Magnoliabiondii)、玉兰(Magnoliadenudata)或武当玉兰(Magnoliasprengeri)的干燥花蕾[1]。辛夷原植物花蕾紧凑，鳞毛整齐，芳香浓郁。主产区为河南南召，分布于河南、陕西和贵州等地。其主要含挥发油，有丁香油酚、茴香油。具有辛散温通、芳香走窜、上行头面、善通鼻窍等功效[2]，药用价值颇高。二乔玉兰(Magnoliasoulangeana)为玉兰与紫玉兰的杂交种，落叶小乔木，下面具柔毛，花先于叶开放，果实同玉兰。紫玉兰(Magnolialiliiflora)为木兰科木兰属常见植物，其花芳香淡雅，孤植或丛植都很美观；花蕾被淡黄色绢毛，花叶同时开放。望春玉兰(Magnoliabiondii)又名望春花、迎春树、辛兰，属木兰科木兰属多年生落叶乔木，花先于叶开放。黄山木兰(Magnoliacylindrica)为落叶小乔木，花先于叶开放，中国特有种，零星分布于安徽、浙江、江西、福建，是国家三级保护植物[3]。景宁玉兰(Magnoliasinostellata)为木兰属新种，聚合果成熟时通常为长圆状圆柱形，常因心皮不育而偏斜弯曲。荷花玉兰(Magnoliagrandiflora)的叶厚革质，叶面深绿色，有光泽，花白色。

近年来，应用中药材防病治病的人越来越多，造成地道药材严重紧缺，市场上供不应求，部分药材由于过分追求利润出现了混伪品，以假乱真，严重地影响人民的用药安全和身体健康[4]。目前有很多学者基于各种不同的方法对辛夷及其混伪药材进行了相关研究[5-7]，但传统的中药材鉴定方法，如形态、显微结构和化学指纹图谱等，都有其自身不足。药材性状易受地理环境、生长期、贮存条件等因素的影响，从而影响鉴定的准确性；化学分析法会因中药活性成分的含量受到其生理条件、采收、贮藏等因素的影响；HPLC、CE、MS等化学仪器设备价格昂贵，一般实验室难以承担。随着近几年中药材DNA条形码鉴定研究的不断深入，中药材鉴定也迎来一次新的技术革命。DNA条形码技术是利用标准的、有足够变异的、容易扩增且相对比较短的DNA片段在种内的特异性和种间多样性而建立的一种新的识别系统，从而实现对物种的快速自动鉴定过程[8]。我国首次提出将ITS2序列作为药用植物鉴定的通用条形码序列，并建立了以ITS2为核心、psbA-trnH为补充序列的植物类药材DNA条形码鉴定体系，为中药材的物种鉴定研究提供了方便又快捷的方法，可以在更大范围应用于生态保护和资源有效利用研究，摆脱了传统形态鉴定方法依赖长期经验的障碍，是中药分子鉴定方法学上的一个创新[9]。

ITS序列是核糖体DNA的内转录间隔区，即5.8S rDNA和28S rDNA基因间隔序列。它的长度与序列变化比较大，并且易于扩增，具有进化速度快和变异性高的特点，将其扩增物进行序列分析，可用于对种、属进行鉴别，甚至用于区分关系非常近的种。陈士林等[10]首次提出将ITS2序列作为药用植物鉴定的通用条形码。随后，DNA条形码分子鉴定方法在药材鉴定方面得到快速发展以及应用，山茱萸、羌活、秦艽、人参、枸杞、金银花等研究验证了序列ITS2作为DNA条形码鉴定药材的准确性和稳定性。车建等[11]应用ITS序列对西红花与其易混中药材进行了鉴定；高晓霞等[12]对广佛手rDNA ITS序列进行了分析，表明ITS序列可为鉴定佛手提供分子依据。

本实验采用玉兰、望春玉兰与其混伪品二乔玉兰、紫玉兰、黄山木兰、景宁木兰和荷花玉兰，通过对样本进行基因组总DNA的提取，用ITS序列通用引物进行PCR扩增和双向测序，并基于K2P模型进行遗传数据分析，建立了系统发生树和条形码评估系统。根据ITS序列差异特征，可准确、有效地鉴别辛夷药材及其混伪品，为木兰科植物的形态变异及多样性保护提供新分子水平的依据。

1 材料与方法

1.1 材料来源

玉兰、二乔木兰、紫玉兰、黄山木兰均采自陕西省西安市西安植物园。采集过程中要注意选择无病虫害、长势较好的完整新鲜叶片进行随机采集，将采集到的叶片擦洗干净，直接存放到变色硅胶中，用塑料袋包扎好，常温保存。玉兰、景宁木兰和荷花玉兰植物的ITS序列均从Genbank网站下载。经比对剪切后共21条序列。具体信息见表1。

1.2 DNA提取、PCR扩增及序列测定

采用天根公司植物DNA 提取试剂盒(Tiangen Biotech Co., China)提取样品总DNA。PCR引物为ITS通用引物：ITS5:GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG；ITS4: TCCTCCGCTTATTGATATGC。PCR反应条件为：97 ℃预变性3 min，94 ℃变性1 min，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，32个循环后，72 ℃延伸10 min。扩增反应采用20 μL的反应体系：包括30～60 ng的模板DNA，2 μL 10× buffer，0.5单位的Taq DNA聚合酶(5 U/μL)，1.5 μL的MgCl2(25 mol/L)，1.5 μL的dNTPs (10 mmol/L)，正反向引物各2 μL(5 μmol/L)，再添加蒸馏水至20 μL。扩增得到的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测合格后，用华大基因有限公司的纯化试剂盒纯化并双向测序。

表1 材料来源

1.3 数据分析

将获得的DNA序列用Bioedit软件进行比对。用MEGA 5.0计算种间的遗传距离和T、C、A、G的含量等，并基于K2P双参数模型用NJ法1000次重复BOOTSTRAP检验各分支的支持率，将比对过的序列构建系统发育树以便直观鉴定各物种。衡量DNA条形码的一个重要的指标是“barcode gap”是否存在，即序列的种间变异要足够大，种内变异要足够小，从而在中间形成一个明显的间隔区。本文用Meier等的TaxonDNA软件结合一般的统计软件构建出能够体现种间遗传距离的分布频度的柱形图[13]。

2 结果与分析

2.1 种内、种间序列比对分析

将辛夷等7种易混药材的ITS序列比对后总长度为1514 bp，其中变异位点34个，占总位点的2.25%，所能提供的信息比较多。 分析表明T、C、A、G的平均含量分别为34.3%、18.8%、29.0%、17.9%。变异多发生在种间，如荷花玉兰MagnoliagrandifloraKJ510880.1、MagnoliagrandifloraKF740420.1、MagnoliagrandifloraAM889723.1、MagnoliagrandifloraJX495733.1、MagnoliagrandifloraJN050023.1在67(T-G)、69(C-A)、374(T-C)等位点；景宁木兰MagnoliasinostellataJN050071.1在374(T-C)、448(C-T)、533(G-A)、602(A-G)、721(A-G)、754(C-A)、762(A-C)等位点；望春玉兰MagnoliabiondiiJN050031.1、MagnoliabiondiiJN050032.1在721(A-G)、754(C-T)、762(A-C)等位点；紫玉兰Magnolialiliflora在490(C-T)、533(G-A)、623(G-A)、971(G-A)、979(G-A)、1008(T-G)等位点；二乔木兰Magnoliasoulangeana在490(C-T)、533(G-A)、623(G-A)、979(G-A)等位点；黄山木兰Magnoliacylindrica在490(C-T)、533(G-A)、762(A-C)、1008(T-G)等位点均出现了种间变异且较明显。

2.2 辛夷及其混伪品的K2P遗传距离分析

遗传距离也是衡量种间及种内关系的一个重要指标，表2、图1均显示了ITS序列在辛夷药材等近缘种种内及种间的K2P距离分布。其中表2为种间、种内距离分布，图1为遗传距离在种内及种间的频率分布图。由表2可知：种间距离最大的是荷花玉兰和紫玉兰之间，为0.017。辛夷药材的主要来源为玉兰、望春玉兰和武当玉兰，由于本文未采到武当玉兰的样品，Genbank中也未搜索到武当玉兰的序列资源，因此本文仅针对前两者进行分析。遗传距离显示：虽然植物学上玉兰与望春玉兰为两个独立的物种，但两者遗传距离较小，仅为0.003(二乔玉兰为玉兰与紫玉兰的杂交种，分类地位不考虑在内)，因此两者亲缘关系最近，化学成分相似，同作为辛夷药材的基源植物。与辛夷遗传距离最远的是荷花玉兰，为0.017，表明两者的分化时间最长，差异最大。

由图1可知，在0.5%～1.0%频率上出现了种间和种内距离的累计频率的重叠，表明该序列的种内距离和种间距离重叠不多，在各个频率上分布较明显。

表2 辛夷等7种药材的种间K2P距离统计(括号内为种内距离)

图1 ITS片段种内种间K2P距离频率直方图

2.3 聚类分析

虽然在K2P距离中种间种内距离有少许重叠现象(0.5%～1.0%)，但由NJ法生成的聚类树中(图2)可以看出：7种植物药材均能独立聚为一支。荷花玉兰的7个个体与其余几个种亲缘关系最远，在聚类树中分化出来最早；其余各种中景宁玉兰仅次于荷花玉兰，位于底端；剩余物种中，望春玉兰较早分出，玉兰和黄山木兰组成了梳子状结构，表明两者亲缘关系较近；二乔玉兰由于是杂交种，遗传结构比较复杂，因此部分个体和紫玉兰聚在了一起，两者区分度不高，但紫玉兰个体自己能聚成一个单系。该聚类树结果表明荷花玉兰在木兰属植物中是最原始的物种，紫玉兰是木兰属中最进化的物种，作为辛夷药材的望春玉兰和玉兰进化地位居中。另外，黄山木兰在遗传上与玉兰差别较小，极易混淆。

3 讨论

本文分析了辛夷(玉兰及望春玉兰)及其近缘易混伪品二乔玉兰、紫玉兰和黄山木兰等7种药材基源植物的ITS序列，包括序列特征、K2P距离及系统进化树。结果表明：辛夷几种药材的ITS序列经扩增测序比对后得到1514 bp序列，变异位点占总位点的2.25%。荷花玉兰和紫玉兰遗传距离最大，黄山木兰和望春玉兰，玉兰和望春玉兰之间的遗传距离均最小。柱形图结果在种内种间区分明显。NJ系统树能将上述几种药材区分开，表明ITS序列可以作为辛夷及其伪品药材鉴定的DNA条形码。

bootstrap 1000次重复，枝上数值仅显示自展支持率>50%。

从实验方法上来看，各样品植物ITS序列的PCR反应条件及通用引物应用情况均表现良好，电泳条带清晰，测序结果稳定。表明该属物种的ITS引物结合区间并未发生变异或有其他的特殊结构，且在采样不足的情况下，在Genbank中也有丰富的序列信息可供参考。从聚类结果可以看出，大部分物种均能各自聚成一个单系，且支持率较高，表明这些物种之间的遗传距离是可以区分辛夷及其伪品之间的相互关系的。此外，玉兰和望春玉兰都作为辛夷的基源植物，两者化学成分相似，遗传距离较小，进化时间较短，亲缘关系比其他物种间的亲缘关系要近得多。因此，两者同作为辛夷的基源植物是有其遗传基础的。另外值得注意的是黄山木兰与玉兰的遗传关系较近，一方面我们根据这个信息可以检测黄山木兰中是否含有与玉兰和望春玉兰等相似的化学成分，使得该植物可以作为辛夷的备选药材，如果黄山木兰中的化学成分与玉兰和望春玉兰等无相同或相似之处，则我们在以后的临床用药中应特别注意该物种，避免与辛夷正品药材相混淆。

本文除上述结果外依然存在些不足，如采集的样品不够丰富，同种药材如玉兰分布较广，但本文只有一个样品，导致遗传信息不全。因此，在以后的研究中，如该药材分布广泛，应扩大其采样范围，保持其遗传信息的完整。

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