食管鳞癌患者血浆lncRNA TUC338表达变化及其临床意义

孙开颜，赵新炜，杨丽君，董翠翠，董树岭，尹惠卿，明亮，贺付成

(1 郑州大学第一附属医院，郑州450052；2 天津儿童医院)

食管癌的主要组织学类型为鳞癌和腺癌，其中90%以上为鳞癌[1]。据统计，食管鳞癌(ESCC)早期诊治者5年生存率可超过90%[2～4]。但目前临床上缺少早期诊断敏感、特异的无创性诊断技术或指标。长链非编码RNA(lncRNA)是一种没有编码功能、长度大于200 nt的功能性RNA分子，其不编码蛋白质，而是以RNA的形式在表观遗传调控、基因转录调节、转录后加工等方面调控基因表达[5]。在体内，lncRNA可参与多种生物学过程的调控，在细胞分化、胚胎与组织发育等多种生命活动中发挥重要作用[6～8]。近年研究发现，肿瘤患者血浆lncRNA水平特异性变化与病情进展有关，可能作为癌基因或抑癌基因参与肿瘤的发生、发展[9～11]。推测lncRNA有可能成为一种ESCC早期诊断的非侵入性肿瘤生物标志物。本研究观察了ESCC患者血浆lncRNA TUC338表达变化，并分析lncRNA TUC338早期诊断ESCC的潜在价值，旨在为寻找新的肿瘤生物标志物提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2016年7月～2017年1月郑州大学第一附属医院收治的ESCC患者116例(ESCC组)。所有患者经消化内镜活检或术后组织病理检查明确诊断，术前未接受任何抗肿瘤治疗。排除伴发器质性或系统性疾病，如糖尿病、高血压等，以及合并其他肿瘤者。其中，男56例、女60例，年龄45～84(65.76±7.83)岁；肿瘤直径：≤3 cm 54例，>3 cm 62例；肿瘤部位：胸上段41例，胸中段39例，胸下段36例；组织分化程度：高中分化65例，低未分化51例；TNM分期：Ⅰ、Ⅱ期53例，Ⅲ、Ⅳ期63例；有淋巴结转移59例，无淋巴结转移57例。同期另选在本院体检的健康者39例(对照组)，男21例、女18例，年龄44～85(65.62±7.24)岁。两组性别、年龄具有可比性。本研究经郑州大学第一附属医院医学伦理委员会批准，患者均知情同意。

1.2 血浆和食管组织lncRNA TUC338表达检测 ①样本收集与处理：ESCC组于术前、对照组于体检日采集空腹静脉血2 mL，置于EDTA-K2抗凝管中，静置20 min，3 000 r/min离心10 min，小心将上层血浆转移至新的EP管中，12 000 r/min离心10 min，将上层血浆再次转移至新的EP管中，-80 ℃保存备用。另选ESCC组织及其配对的癌旁正常组织(距癌组织边缘>5 cm)，置于RNA保存液中，-80 ℃保存备用。②血浆和食管组织总RNA提取：取上述血浆250 μL，加入TRIzol LS 750 μL，充分混匀，按照TRIzol LS试剂盒说明提取总RNA；取癌组织及其配对的癌旁正常组织各30 mg，液氮下研磨成粉末，然后加入TRIzol 1 mL，充分混匀，按照TRIzol试剂盒说明提取总RNA。经NanoDrop 2000C紫外分光光度计检测，OD260/OD280为1.8～2.0，表明提取的总RNA纯度合格，调整总RNA浓度至300 ng/μL进行后续实验。③逆转录反应：将总RNA按PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒说明逆转录为cDNA，所得cDNA -20 ℃保存。④实时荧光定量PCR：lncRNA TUC338及其内参GAPDH引物由上海生工生物工程有限公司设计合成。引物序列：lncRNA TUC338上游引物5′-TCCACAGGACAGGTACAGCA-3′，下游引物5′-GCCTTGGAGACTGAACATCC-3′；GAPDH上游引物5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，下游引物5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。取cDNA 2 μL，按SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒说明进行PCR扩增。PCR反应体系共20 μL：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus，2×)10 μL，PCR Forward Primer 0.8 μL，PCR Reverse Primer 0.8 μL，DNA 模板2 μL，dH2O 6.4 μL；反应条件：95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s、58 ℃退火34 s共40个循环。以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt法计算lncRNA TUC338相对表达量。实验重复3次，取平均值。

1.3 相关性分析 随机选择46例ESCC患者，采用Spearman秩相关分析法分析血浆与肿瘤组织lncRNA TUC338表达的关系。分析血浆lncRNA TUC338表达与ESCC患者临床病理参数的关系。

1.4 血浆lncRNA TUC338表达对ESCC的诊断效能分析 绘制血浆lncRNA TUC338表达诊断ESCC的受试者工作特征(ROC)曲线，计算曲线下面积。以cut off值为截断值，计算血浆lncRNA TUC338表达诊断ESCC的敏感性及特异性。

2 结果

2.1 两组血浆lncRNA TUC338表达比较 ESCC组及对照组血浆lncRNA TUC338相对表达量分别为2.60±0.83、1.03±0.32，二者比较P<0.01。

2.2 ESCC组织及癌旁正常组织lncRNA TUC338表达比较 ESCC组织及癌旁正常组织lncRNA TUC338相对表达量分别为2.47±0.69、1.02±0.29，二者比较P<0.01。

2.3 ESCC患者血浆与肿瘤组织lncRNA TUC338表达的关系 Spearman秩相关分析显示，ESCC患者血浆与肿瘤组织lncRNA TUC338表达呈正相关关系(r=0.643，P<0.01)。

2.4 血浆lncRNA TUC338表达与ESCC患者临床病理参数的关系 见表1。

表1 血浆lncRNA TUC338表达与ESCC患者临床病理参数的关系

2.5 血浆lncRNA TUC338表达对ESCC的诊断效能 ROC曲线分析显示，血浆lncRNA TUC338表达诊断ESCC的曲线下面积为0.684(95%CI： 0.567～0.780，P<0.01)，其cut off值为1.415，此时其诊断ESCC的敏感性为63.4%、特异性为78.1%。

3 讨论

研究发现，lncRNA在血液中稳定性较高，可通过包被在外泌体、微泡等微粒中免于被核糖核酸酶降解，而且在室温下放置24 h以上甚至反复冻融亦相当稳定[12]。与miRNA一样，lncRNA亦能存在于肿瘤患者尿液、唾液和血液中[13]，如lncRNA HOTTIP-005在胰腺癌患者血浆中异常表达，可作为胰腺癌诊断和患者预后判断的潜在生物标志物[14]；lncRNA-HEIH在肝细胞癌患者血浆中高表达，其表达变化与肝细胞癌病情进展有关，可用于肝癌的早期诊断以及患者预后监测[15]。因此，血浆中某些核酸分子水平变化有助于肿瘤的诊断[16]。但血浆lncRNA能否作为ESCC早期诊断的生物标志物尚不十分清楚。

人TUC338序列全长590 bp，基因位于12号染色体。多聚胞嘧啶结合蛋白2基因独立转录形成UC338转录片段，TUC338为克隆该转录片段而来。Braconi等[17]研究发现，TUC338在人肝细胞癌中表达显著增加，沉默TUC338表达可抑制肝癌细胞生长。牟丽莎等[18]研究发现，应用RNAi技术下调TUC338表达可使膀胱癌细胞凋亡增加，推测TUC338可作为膀胱癌药物治疗潜在的作用靶点。Ouyang等[19]研究发现，抑制TUC338表达后，CAL-27和SCC-9两种舌鳞癌细胞增殖均受到抑制，细胞凋亡增加，说明TUC338可参与舌鳞癌的发生、发展。本研究结果显示，ESCC组血浆lncRNA TUC338相对表达量明显高于对照组；ESCC组织lncRNA TUC338相对表达量明显高于癌旁正常组织。提示lncRNA TUC338可能在ESCC发生、发展过程中具有癌基因作用。

本研究还发现，ESCC患者血浆与肿瘤组织lncRNA TUC338表达呈正相关关系，说明血浆lncRNA TUC338表达可反映肿瘤组织lncRNA TUC338表达。进一步研究发现，血浆lncRNA TUC338表达与ESCC组织TNM分期有关。肿瘤恶性程度越高，血浆lncRNA TUC338表达越高，提示血浆lncRNA TUC338可能参与ESCC的恶性转化。本研究ESCC有淋巴结转移者血浆lncRNA TUC338表达高于无淋巴结转移者，提示血浆lncRNA TUC338可能参与ESCC的侵袭和转移。本研究ROC曲线分析显示，血浆lncRNA TUC338诊断ESCC的敏感性为63.4%、特异性为78.1%，提示血浆lncRNA TUC338有可能作为诊断ESCC的潜在生物标志物。但由于本研究样本量较少，其结论还有待于进一步研究证实。

综上所述，ESCC患者血浆LncRNA TUC338高表达，其表达变化与肿瘤TNM分期、淋巴结转移有关；血浆LncRNA TUC338有可能作为诊断ESCC的潜在生物标志物。

参考文献：

[1] Rustgi AK, El-Serag HB. Esophageal carcinoma[J]. N Engl J Med, 2014,371(26):2499-2509.

[2] Hong L, Han Y, Zhang H, et al. Prognosis-related microRNAs in esophageal cancer[J]. Expert Opin Biol Ther, 2014,14(4):483-489.

[3] Zhang HL, Liu RL, Shi YT, et al. Analysis of the survival in patients after surgical resection of thoracic esophageal cancer[J]. Zhonghua Zhong Liu Za Zhi, 2009,31(7):541-545.

[4] Pennathur A, Gibson MK, Jobe BA, et al. Oesophageal carcinoma[J]. Lancet, 2013,381(9864):400-412.

[5] Shen Z, Li Q, Deng H, et al. Long non-coding RNA profiling in laryngeal squamous cell carcinoma and its clinical significance: potential biomarkers for LSCC[J]. PLoS One, 2014,9(9):e108237.

[6] Ge Y, Yan X, Jin Y, et al. MiRNA-192 [corrected] and miRNA-204 Directly Suppress lncRNA HOTTIP and Interrupt GLS1-Mediated Glutaminolysis in Hepatocellular Carcinoma[J]. PLoS Genet, 2015,11(12):e1005726.

[7] Sahu A, Singhal U, Chinnaiyan AM. Long noncoding RNAs in cancer: from function to translation[J]. Trends Cancer, 2015,1(2):93-109.

[8] Mehta SL, Kim T, Vemuganti R. Long noncoding RNA fosDT promotes ischemic brain injury by interacting with REST-associated chromatin-modifying proteins[J]. J Neurosci, 2015,35(50):16443-16449.

[9] Tong YS, Wang XW, Zhou XL, et al. Identification of the long non-coding RNA POU3F3 in plasma as a novel biomarker for diagnosis of esophageal squamous cell carcinoma[J]. Mol Cancer, 2015(14):3.

[10] Rivas A, Burzio V, Landerer E, et al. Determination of the differential expression of mitochondrial long non-coding RNAs as a noninvasive diagnosis of bladder cancer[J]. BMC Urol, 2012(12):37.

[11] Shao Y, Ye M, Jiang X, et al. Gastric juice long noncoding RNA used as a tumor marker for screening gastric cancer[J]. Cancer, 2014,120(21):3320-3328.

[12] Huang X, Yuan T, Tschannen M, et al. Characterization of human plasma-derived exosomal RNAs by deep sequencing[J]. BMC Genomics, 2013(14):319.

[13] Hauptman N, Glavac D. Long non-coding RNA in cancer[J]. Int J Mol Sci, 2013,14(3):4655-4669.

[14] Wang Y, Li Z, Zheng S, et al. Expression profile of long non-coding RNAs in pancreatic cancer and their clinical significance as biomarkers[J]. Oncotarget, 2015,6(34):35684-35698.

[15] 杨哲锋，李娟，马志元，等.血浆LncRNA-HEIH表达水平与肝癌发病风险的关联分析[J]. 现代肿瘤医学，2015，23(1)：80-84.

[16] Wang J, Zhang KY, Liu SM, et al. Tumor-associated circulating microRNAs as biomarkers of cancer[J]. Molecules, 2014,19(2):1912-1938.

[17] Braconi C, Valeri N, Kogure T, et al. Expression and functional role of a transcribed noncoding RNA with an ultraconserved element in hepatocellular carcinoma[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2011,108(2):786-791.

[18] 牟丽莎，朱书，蔡志明.TUC338在膀胱癌中的表达及作用机制研究[J].深圳中西医结合杂志，2016，26(20)：1-3.

[19] Ouyang KX, Zou R, Liang J, et al. TUC338 overexpression leads to enhanced proliferation and reduced apoptosis in tongue squamous cell carcinoma cells in vitro[J]. J Oral Maxillofac Surg, 2017,75(2):423-428.