猪圆环病毒2型TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与应用

李晓菲 陈婷 孙爱荣 黄艳 葛晓杰 徐婷 王彩宏 秦立廷

摘要：为了检测猪圆环病毒2型（Porcine Circovirus 2，PCV2）并对其进行准确定量，试验根据PCV2基因序列设计引物和探针，建立了一种特异性检测PCV2的TaqMan荧光定量方法。结果表明：该方法特异性良好;在5.Oxl0¹～5.O×l0⁹拷贝/u L模板范围内具有良好的线性关系;敏感性是常规聚合酶链式反应（PoLymerase Chain Reaction，PCR）方法的100倍：重复性试验变异系数小于1.5%。与常规PCR方法相比，该方法对临床样品的检出率更高。该方法的建立为PCV2的实验室诊断、流行病学调查以及研究PCV2核酸载量与临床致病性关系提供了快速、准确的检测依据。

关键词：猪圆环病毒2型;荧光定量方法;临床样品

中图分类号：S852.65

文献标志码：A

文章编号：1001-0769（2018）10-0030-03

猪圆环病毒（Porcine Circovlrus，PCV）属于圆环病毒科、圆环病毒属，是一种无囊膜的单股环状DNA病毒，也是目前发现的最小的动物病毒。PCV具有三个血清型，即PCV1、PCV2和PCV3。PCV1是一种可以感染猪的常规病毒，对猪无致病性。PCV2于1998年首次报道，对猪具有致病性，临床上主要引起断奶仔猪多系统衰竭综合征、皮炎肾病综合征、繁殖障碍以及呼吸道和肠道疾病。2016年10月美国报道出现一种新的圆环病毒血清型-PCV3，该病毒能引起猪的皮炎肾病综合征、繁殖障碍及心脏和多系统的炎症反应。

目前，PCV2临床样品常用的实验室诊断方法有聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）、间接免疫荧光试验、病毒分离鉴定以及序列测定等。这些常规方法操作繁琐、耗时长，并且在PCV2检测时特异性和敏感性存在不足。荧光定量PCR在常规PCR基础上引入了荧光探针，使得检测方法具有更高的特异性和敏感性，并且PCR结束后可以直接观察结果，无须进一步凝膠电泳。整个试验过程操作简单，用时短，最快可以在2h内得到检测结果。

本研究旨在建立一种快速、准确检测PCV2及其病毒载量的TaqMan荧光定量PCR方法，为PCV2的实验室诊断、病毒定量及流行病学调查提供可靠的工具。

1 材料与方法

CFX96荧光定量PCR仪和Tl00梯度PCR购自伯乐公司、分光光度计购自Thermo公司、质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒购自AxyGen公司、核酸提取试剂盒购自invitrogen公司、PCR酶购自全式金公司、Premix Ex Taq （Probe qPCR）购自宝生物公司。

1.2引物探针设计与合成

应用MegAlign软件对多个PCV2基因序列进行比较分析，在其保守区域设计引物和TaqMan探针。上游引物序列为：5' CTACTGCTGTGAGTACCTTGTTGGA 3，下游引物序列为：5' CAGGGTGCTGCTCTGCAA 3。探针序列为：5' FAM-AGCGGGAGTCTGGT-MGB 3，其中，探针5端标记FAM，3端标记MGB。

1.3标准品制备

通过常规PCR扩增PCV2目的基因，然后将目的产物回收、纯化后与pMD19-T载体连接，转化后提取质粒，经鉴定为阳性的质粒即为标准品。

1.4反应条件优化及标准曲线建立

首先通过温度梯度PCR确定引物的最适退火温度，然后用矩阵法对探针和引物的用量进行摸索与改进，获得最适合的探针引物浓度配比，确定反应体系。将1.3中制备的标准品进行10倍连续倍比稀释，稀释后对5.0×10¹～5.0×10⁹拷贝/u L浓度范围的标准品进行荧光定量PCR反应，获得标准曲线。

1.5特异性、敏感性和重复性试验

利用建立的荧光定量方法对猪瘟病毒（ClassicalSwine Fever Virus，CSFV）、猪伪狂犬病病毒（Pseudoraloies Virus，PRV）、PCV3、猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine Reproductive and RespiratorySyndrome Virus，PRRSV）、猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus， PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible GastroenteritisVirus，TGEV）、猪轮状病毒（Rotavirus，RV）和猪细小病毒（Porcine Parvovirus，PPV）等病毒的互补DNA（Complementary DNA，cDNA）或DNA进行检测验证该方法的特异性。将阳性DNA按10倍稀释至最低浓度为6. 12×10¹拷贝/u L，进行PCR反应，比较两种检测方法的敏感性。用5种浓度的标准品质粒分别进行4次批内和批间重复性试验，并且根据C₊值计算变异系数。

1.6临床样品检测

由本实验室收集可疑PCV2临床样品78份，分别进行荧光定量PCR检测和常规PCR检测，比较分析结果。

2 结果与分析

2.1质粒标准品制备

通过常规PCR扩增PCV2目的基因（图1），产物经回收纯化后连接pMD19-T载体，转化后提取质粒，经鉴定为阳性的质粒即为荧光定量标准品。测定DNA浓度后，换算成拷贝数为5.0×10⁹拷贝/u L，-20℃保存备用。

2.2反应条件优化

荧光定量PCR反应体系共为25 uL，含12.5 uL2×Premix Ex Taq、10uL RNase-free water、0.5 uL探针（10 uM）、0.5U L上游引物（10 uM）、0.5 uL下游引物（10 uM）、1 uL质粒标准品。反应条件为：95℃3 min; 94℃15 s，60℃35 s，40个循环。

2.3荧光定量PCR标准曲线的建立

取浓度为5.0×10¹～5.0×10⁹拷贝/uL的质粒标准品为模板进行荧光定量PCR扩增后获得标准曲线。由图2和图3可知，线性关系良好，标准曲线建立成功，可用于临床样品的检测。

2.4特异性试验

用所建立的荧光定量PCR方法对CSFV、PRRSV、PRV、PEDV、TGEV、RV、PPV和PCV3等病毒的cDNA或DNA的检测结果均为阴性，说明该方法与这些病毒无交叉反应（图4），试验结果表明该方法具有良好的特异性。

2.5敏感性试验

荧光定量PCR方法能检出的最低模板浓度为5.0×10¹拷贝/uL（图2），而常规PCR能检出的最低模板浓度为6. 12×10³拷贝/uL（图5），试验结果表明所建立的荧光定量PCR方法的敏感性是常规PCR方法的100倍左右。

2.6重复性试验

用5种不同浓度的标准品分别进行批内和批间的重复性试验。试验结果表明，批内和批间重复性试验的变异系数均小于1.5%（表1），表明该方法具有良好的重复性与稳定性。

2.7临床样品检测结果

对本实验室收集的可疑PCV2临床样品78份，分别进行荧光定量PCR检测和常规PCR检测。检测结果表明，荧光定量PCR方法阳性检出率（60.3%）比常规PCR方法（48.7%）更高（表2）。说明所建立的荧光定量方法比常规方法具有更高的敏感性，更适用于PCV2的临床检测，尤其是感染早期病毒含量较低时。

3 讨论

PCV2是断奶仔猪多系统衰竭综合征和其他猪圆环病毒相关疾病的原发性病原。虽然PCV2所导致的猪群发病率和死亡率不高，但PCV2主要侵害猪的免疫系统，干扰和破坏猪对其他疫病免疫抗体的产生和维持，从而继发其他疾病，多种疾病引起的混合感染使死亡率升高，从而造成严重的经济损失。因此，PCV2的危害性不能孤立而言，更主要是表现在与其他疾病的继发混合感染。

目前，PCV2的检测以血清学检测和病原学检测为主。由于受到母源抗体的影响，血清学抗体检测普遍呈阳性，临床指导意义不大。因此病原学检测对于PCV2的预防与控制尤为重要。由于PCV2临床发病与亚临床感染猪群中病毒含量存在明显不同，PCR灵敏度较差，易造成漏检，而荧光定量PCR方法可以对抗原含量进行准确定量，敏感性高，特異性好，并且整个过程所需时间更短，因此在病原检测领域的应用也越来越广泛。

本研究根据DNA序列数据库（GenBank）中PCV2基因序列设计引物和探针，建立了一种快速检测PCV2病毒载量的TaqMan荧光定量PCR方法。通过优化，使该方法在5.0×10¹～5.0×10⁹拷贝/uL范围内具有良好的线性关系，敏感性是常规PCR方法的100倍。综上所述，该方法的建立为PCV2的实验室诊断、流行病学调查以及研究PCV2核酸载量与PCV2临床致病性关系提供了快速、准确的检测依据。

（参考文献：3篇，略）