高产葡萄糖酸黑曲霉菌株的诱变选育

白长胜 孟维珊

摘要：以一株产葡萄糖酸的黑曲霉为出发菌株，对其进行紫外线诱变处理，筛选得到一株产葡萄糖酸较高的菌株，产酸力比原始菌株提高了1. 16倍，经连续传代7代，产酸性能未出现较大的差异，具有较好的遗传稳定性。

关键词：黑曲霉；葡萄糖酸；紫外线诱变；产酸能力

中图分类号：TQ921.2

文献标识码：A

文章编号：2095-9737（2018）08-0001-02

葡萄糖酸及其衍生物（如葡萄糖酸盐、葡萄糖酸δ- 内酯）作为蓬松剂、凝固剂、鳌合剂、酸味剂而广泛应用于食品、化工、水处理、建材和医药等行业[1-2]。葡萄糖酸的生产方法包括发酵法、均相化学氧化法、电解氧化法和多相催化氧化法[3]。生物发酵法是当前国内生产葡萄糖酸最有竞争力的生产方法，具有发酵周期短、发酵过程易于控制、发酵液纯度高、产品易于提取、设备要求低等优点。能发酵葡萄糖产生葡萄糖酸的微生物很多，工业上主要使用黑曲霉发酵生产葡萄糖酸[4-5]。

紫外线诱变是一种使用最早、沿用最久且应用效果明显的诱变方法，该方法设备简单、操作方便、成本低廉、诱变频率高、诱变效果明显，迄今仍然是微生物育种中最常用和有效的诱变方法之一。本研究以筛选到的产葡萄糖酸性能较高的黑曲霉为出发菌株，利用紫外线诱变处理原始菌株，筛选得到产酸能力高、遗传性能稳定的突变菌株。

1 材料与方法

1.1 菌种

黑曲霉YS由黑龙江省畜牧研究说微生物实验室筛选并保藏。

1.2 培养基

1.2.1 斜面培养基

葡萄糖60 g/L，尿素0.2 g/L，KH2P04 0.13 g/L，MgS04.7H20 0.02 g/L，玉米浆l g/L，CaC035 g/L，琼脂25 g/L，pH值6.5～7.O，121℃，灭菌15 min。

1.2.2 平板培养基

葡萄糖250 g/L，尿素0.2 g/L，KH2P04 0.13 g/L，MgS04·7H20 0.02 g/L，玉米浆1 g/L，CaC03 10 g/L，琼脂18 g/L，pH值6.5～7.0，121℃，灭菌20 min。

1.2.3 种子培養基

葡萄糖240 g/L，尿素0.2 g/L，KH2 P040.64 g/L，玉米浆7.2 g/L，CaC03 10 g/L，pH值6.5～7.0，121℃，灭菌20 min。

1.2.4 发酵培养基

葡萄糖300 g/L，尿素0.1g/L，KH2 P040.02 g/L，MgS04·7H20 0.2g/L，CaC03 40 g/L，pH值6.5～7.0，121℃，灭菌20 min。1.3 试剂与仪器

试剂：葡萄糖，尿素，MgS04.7H20，KH2 P04，琼脂，CaC03，甲醇，磷酸。

仪器：摇床，培养箱，超净工作台，高压灭菌锅，磁力搅拌器，血球计数板，显微镜，高效液相色谱仪，pH计。

1.4 方法

1.4.1 单孢子悬液制备

黑曲霉YS作为出发菌株，用无菌水5 mL冲洗下培养好的新鲜斜面孢子，用玻璃珠打散，脱脂棉过滤，制得单孢子悬浮液，取0.5 mL用无菌生理盐水适当稀释后用平板菌落计数法测菌悬液浓度[6]，调整孢子液浓度为每毫升l07～l08个孢子。

1.4.2 紫外诱变

取5 mL孢子悬液于直径5 cm培养皿中，加入自制转子，置于磁力搅拌器上，在15 W紫外灯下、距离30 cm分别照射不同时间，然后将处理液梯度稀释后取104稀释度菌悬液0.1 mL处理液涂布于分离培养基平板，35℃避光培养3～5天后，进行菌落计数。以未诱变菌液培养后的菌落数为基准计算不同诱变时间的致死率，绘制致死率曲线，确定诱变剂量并进行诱变。

致死率（%）=（对照皿的菌落总数诱变处理后的菌落总数）/对照皿的菌落总数×100%

1.4.3 突变株的筛选

初筛：将菌落周围溶圈直径与菌落直径比值较大的菌株挑至斜面上，纯化后进行复筛发酵。

复筛：挑取活化后的菌种接种于装有40 mL种子培养基的150 mL三角瓶中，38℃、200 r/min振荡培养24 h，然后取5 mL转接于装有100 mL发酵培养基的500 mL三角瓶中，38℃、300 r/min振荡培养24 h，滤纸过滤后测定发酵液中葡萄糖酸的含量，以原始菌株YS产葡萄糖酸量作为对照，选取产酸量较高的菌株。

1.5 葡萄糖酸含量的测定

过滤后的发酵液稀释100倍后，用HPLC测定葡萄糖酸含量。

HPLC检测条件：色谱柱为Amethyst C18 H（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为甲醇：水：1%磷酸一50：450：500，流速1.O mL/min，检测波长210 nm，进样量10 μL。

1.6 菌株遗传稳定性实验

将诱变菌株连续传代7代后，7代菌株同时进行发酵实验，测定产酸量。

2 结果

2.1 紫外诱变剂量的选择

采用紫外线诱变方法将菌悬液用紫外线分别照射o、0.55、l、1.5、2、2.5、3、3.5、4、5 min后，通过平板菌落记数法计算致死率，绘制紫外照射致死率曲线，结果如图l所示。

紫外照肘o.5 min的致死率为43. 3%，1 rmn的致死率为75. 8%，1.5 min的致死率为88. 7%，2 min的致死率为95. 2%，2.5 min的致死率为99.7%，照射3 min及以上的致死率为100%。根据诱变育种的产量变异中大多倾向于采用较低剂量的原则[7]，本试验选取致死率为80%的诱变剂量，将紫外诱变紫外线照射的时间取为1.5 min。

2.2 紫外诱变筛选

紫外照射后的菌株涂布平板，初筛后共挑取117株，经摇瓶复筛测产算量，以YS产葡萄糖酸量为100%，产酸量提高的菌株有61株，但多数提高幅度不大，其中6株突变株的产酸能力提高到YS诱变前的1.1倍以上，结果见表l。

2.3 菌株的遗传稳定性

以诱变后产酸量提高明显的6株菌株为实验菌种，在斜面上连续传代7代，将所有代次菌株接种摇瓶发酵，测定产酸量，绘制突变株产酸稳定性曲线，结果如图2。

Fig2 The stability of acid production by mutant strains

由图2可知，而菌株UF13、UF35、UF62和UF74的产酸不够稳定，随着代数增加它们的产酸能力均有所下降。菌株UF20和UF107产酸性能基本稳定，表明二者遗传稳定性良好。UF107的产酸性能优于UF20，因此选用菌株UF107作为以后发酵产酸的出发菌株。

3 讨论

葡萄糖酸与碳酸钙反应在平板上形成透明圈，本研究采用透明圈法作为初步判定菌株产酸能力强弱的依据。一般认为透明圈直径比与产酸量呈现正相关性。透明圈越大，产酸越多；透明圈出现得越早，产酸越快，在实验中筛选得到的多数突变菌株产酸能力符合这种正相关性。采用这种初筛方法大大提高了筛选效率。

本试验通过紫外线诱变处理黑曲霉原始菌株YS，最终筛选得到一株产葡萄糖酸能力提高且性状稳定的菌株UF107，产酸力是原始菌株1.16倍。

参考文献：

[1]谢冬梅，韦礼宁，周朝晖，等，葡萄糖酸系列产品的研制[J].广西化工，2000，9（1）：17-19.

[2] SUMITRA RAMACHANDRAN， PIERRE FONTANILLE，ASHOK PANDEY. Gluconic Acid： Properties， Applicationsand Microbial Production[J]. Biotechnol， 2006， 442： 185- 195.

[3]郭凤华，刘昌俊，葡萄糖酸合成方法研究进展[J].化學丁业与工程，2007，24（2）：173-177.

[4] SINGH OV， RAJ KUMAR. Biotechnological production of glu-conic acid： future implications[J]. Appl Microbiol Biotechnol，2007（75）：713-722.

[5]金其荣，张维民，徐勤，有机酸发酵工艺[M].北京：轻工业出版社，1989.

[6]沈萍，微生物学[M].北京：高等教育出版社，2000：231- 232.

[7]周德庆，微生物学教程[M].北京：高等教育出版社，2002：217.