黑色素瘤模型的建立与评价

姚香利 苗旭光 魏茜茜 王暄 刘守信

摘 要：为了快速有效地进行在体药物筛选，研究了以小鼠黑色素实体瘤组织中的原代细胞构建黑色素瘤模型的方法。从荷黑色素瘤小鼠的组织中提取原代肿瘤细胞，与体外培养的B16细胞通过皮下注射分别植入两组C57BL/6小鼠体内，考察两组小鼠肿瘤显现时间和生长速度。结果表明：当接种浓度为5.0×106个/ mL、每只0.2 mL时，小鼠黑色素瘤原代细胞和体外培养的B16细胞成瘤率分别为100%和80%，且小鼠右前肢肿瘤（大小约4 mm3）出现时间分别约在第3天和第8天。紫杉醇对两种模型的初步评价显示，与体外培养的B16细胞模型相比，原代B16细胞模型是体内筛选和评价特定化合物抗肿瘤活性的一种可行而有效的方法，成瘤时间较短、成瘤率高，所得实验数据误差也较小。模型的建立为相关药物评价模型的开发研究提供了一条可借鉴的新途径。

关键词：分子药理学；黑色素瘤；原代细胞；C57BL/6小鼠；B16细胞；接种浓度

中图分类号：R332；R730.5 文献标志码：A

文章编号：1008-1542（2018）04-0343-06doi：10.7535/hbkd.2018yx04008

Abstract：In order to screen drug rapidly and effectively in vivo， the approach of the establishment for mouse melanoma model with primary cell from melanin solid tumor tissue of mouse is studied. The primary cell and the cultured B16 cells in vitro are implanted into two groups of C57BL/6 mice by hypodermic， respectively. The appearing time and the growth rate of tumor in two groups of mouse are investigated. The results show that when the inoculation is 0.2 mL for each one （the cell concentration of 5.0×106/mL）， the tumor formation rates of the primary tumor cells of mouse melanoma and in vitro cultured B16 cells are 100% and 80%， respectively， and it takes about 3 and 8 days respectively that the tumor sizes become about 4 mm3. The preliminary evaluation of two models are carried out with taxol， showing that the primary B16 cell model is a feasible and effective method for screening and evaluating the antitumor activity of specific compounds in vivo compared with the B16 cell model cultured in vitro， and it has shorter tumor forming time， higher tumor forming rate and less error in the obtained experimental data， which provides a new way for the development and research of related drug evaluation models.

Keywords：molecular pharmacology； melanoma； primary cell； C57BL/6 mice； B16 cell； inoculation density

惡性黑色素瘤是起源于神经嵴的黑色素细胞恶性肿瘤[1]。统计结果表明，在美国，恶性黑色素瘤的年发病人数为88 000人左右，且每小时就有一名恶性黑色素瘤患者失去生命[2]。恶性黑色素瘤的发病率逐年增高[3]，全球各地区均呈持续增长趋势[4]。外科手术治疗中，Ⅰ期、Ⅱ期黑色素瘤患者5年生存率正从80%下降到55%[5-7]。因此，针对治疗恶性黑色素瘤药物的研发已经成为本领域研究的重点之一。人类利用小鼠模型进行癌症研究已有110多年的历史[8]。药物的研发效率常常依赖于动物肿瘤模型的优劣。孟星君等[9]和王淑瑞等[10]在小鼠黑色素瘤模型的建立中均采用将体外培养的小鼠黑色素瘤细胞B16接种于小鼠皮下的方法。

河北科技大学学报2018年第4期姚香利，等：黑色素瘤模型的建立与评价本文通过对比小鼠黑色素瘤组织中提取的原代肿瘤细胞和体外培养B16细胞两种方法所建立的小鼠黑色素瘤动物模型的差异，优选建立更高效的黑色素瘤模型方法，从而为研究黑色素瘤治疗药物的体内实验提供便利途径。以C57BL/6小鼠为实验动物，选取不同浓度的小鼠黑色素瘤B16细胞，在小鼠皮下建立肿瘤模型，优选出最佳的细胞接种浓度；同时，以最佳接种浓度接种从组织中提取的原代肿瘤细胞和体外培养的B16细胞，于两组小鼠右前肢腋窝皮下接种后，观察各组小鼠肿瘤显现时间、肿瘤生长速度，以优选出建立小鼠黑色素瘤动物模型的最佳方法。在此基础上，用临床使用的抗肿瘤药物紫杉醇对所建立的模型进行了初步评价。

1 主要仪器与材料

CO2培养箱（3131），美国Thermo公司提供；低速离心机（5418），德国Eppendorf公司制造。

C57BL/6小鼠，雄性，6～7周龄，17～20 g，SPF级，由河北省实验动物中心（河北医科大学）提供。

B16小鼠黑色素瘤细胞株，由中国科学院上海细胞生物研究所提供；胎牛血清，购自Bovogen Biologicals Pty Ltd；胰蛋白酶，购自Gibco公司；紫杉醇，购于广州爱纯医药科技和西安康诺化工有限公司；细胞完全培养基：将45 mL RPMI-1640（Gibco）+5 mL胎牛血清+500 μL（双抗青霉素100 U/mL和链霉素100 mg/L）充分混匀，用于培养细胞，将细胞置于37 ℃、5%（体积分数，下同）CO2的培养箱中培养。

2 实验方法

2.1 小鼠黑色素瘤B16细胞模型的建立

取对数生长期B16细胞，用PBS洗涤2次，用胰蛋白酶进行消化，胎牛血清终止，轻轻吹打混匀，收集细胞悬浮液。将上述悬浮液置于离心机内，以1 000 r/min转速离心5 min，弃去上清液。加入1 mL基础培养基，轻轻吹打成单细胞悬浮液，以台盼蓝染色，活细胞数在95%以上。用细胞计数板计数，用PBS调整细胞浓度，细胞浓度约为5.0×105，5.0×106，5.0×107个/mL。取C57BL/6小鼠30只，随机平均分为3组，即低浓度组（5.0×105个/mL）、中浓度组（5.0×106个/mL）和高浓度组（5.0×107个/mL），每只接种0.2 mL。用75%的酒精擦拭小鼠右前肢腋窝处进行消毒，取已经调整好浓度的小鼠黑色素瘤B16细胞，接种于相对应的各组小鼠右前肢腋窝皮下，每日触摸小鼠右前肢，观察是否有肿瘤块出现，并隔天记录肿瘤的生长情况。

2.2 原代肿瘤细胞小鼠黑色素瘤模型的建立

首先剥离小鼠皮下的肿瘤块，选择光滑的肿瘤组织，用PBS洗涤。将处理后的肿瘤组织放到培养皿中，加入少量PBS，去除结缔组织和血管组织。用眼科剪将组织剪碎，用胰蛋白酶进行消化，以1 000 r/min转速离心5 min，弃去上清液，分别加入到放有完全培养基的培养瓶中，于培养箱内孵育过夜，贴壁细胞为较纯的原代细胞。将细胞用 PBS洗涤2次，用胰蛋白酶进行消化，胎牛血清终止，轻轻吹打混匀，收集细胞悬浮液[11]。将此悬浮液置于离心机内，以1 000 r/min转速离心5 min，弃去上清液。加入1 mL基础培养基，轻轻吹打成单细胞悬浮液，以台盼蓝染色，活细胞数在95%以上，采用细胞计数板计数，用PBS调整细胞浓度为最佳接种浓度，即5.0×106个/mL。

2.3 原代肿瘤细胞与体外培养B16细胞小鼠黑色素瘤模型平行接种实验

取C57BL/6小鼠20只，随机平均分为2组。用75%的酒精擦拭小鼠右前肢腋窝处进行消毒。第1组接种小鼠黑色素瘤B16细胞，浓度为5.0×106/mL，每只接种0.2 mL；第2组接种小鼠黑色素瘤原代细胞，浓度为5.0×106个/mL，每只0.2 mL。每日触摸小鼠右前肢，观察是否有肿瘤块出现，并记录每天肿瘤的生长情况。

2.4 紫杉醇对两种小鼠黑色素瘤模型的评价

体外培养细胞组和原代肿瘤细胞组建模方法同“2.1”和“2.2”，每组10只C57BL/6小鼠，每组接种小鼠黑色素肿瘤细胞后，观察小鼠右前肢腋窝皮下。发现小鼠右前肢有肿瘤（大小约4 mm3）出现时，视为肿瘤显现时间。次日，以临床使用的紫杉醇为抗肿瘤药物，采用腹腔注射方法给药，剂量为10 mg/kg[12]，周期为21天。重复3次实验，考察两组小鼠肿瘤的变化情况。

2.5 观察指标

观察并记录小鼠的精神状态、饮食、毛色，以及肿瘤外观的形态情况。接种后每日触摸小鼠右前肢腋下，考察肿瘤显现时间、肿瘤生长速度。将出现约4 mm3的肿瘤块时间视为肿瘤显现时间，每日用游标卡尺记录肿瘤的最长径L（mm）、垂直方向最大横径W（mm）、肿瘤体积V（mm3），计算公式为V=LW2/2[13]。

2.6 统计学处理

数据采用SPSS 21.0统计软件进行处理，计量数据以均数±标准差（±s）表示，各组间比较采用t检验进行统计分析，其中差异P<0.05视为有统计学意义。

3 结果与討论

黑色素瘤的致死率非常高，细胞也易于转移。为了筛选出合理的治疗药物，建立快速、有效的黑色素瘤动物模型已成为相关研究的重点之一。裸鼠免疫功能缺陷、存活率低，对操作环境的要求比较严格，且价格相对较为昂贵[14]。而小鼠相对来说在这些方面具有较为明显的优势。所以，在药物初步筛选期间，选择小鼠黑色素瘤作为实验模型的方案在技术上和经济上是可行的。原代细胞取自新鲜剥离的肿瘤组织，其生物学特性尚未发生较明显的变化，仍保留原二倍体遗传性，基因保留量在90%以上，因而更适用于药物敏感性试验，所得数据更具有说服力[15-17]。

参照已报道的文献＼[18—22＼]，本实验采用胰蛋白酶消化法处理肿瘤标本，剔除基质纤维、间质蛋白等组织间质，充分分散组织细胞，以保证在短时间内生长成片，获得较高产量、较高纯度的原代细胞。

3.1 小鼠荷瘤后状态考察

随着B16细胞接种数的不同，C57BL/6小鼠的肿瘤生长速度也不同。接种数越多，肿瘤显现时间越早，肿瘤生长越快，小鼠的基本状况越差。高浓度组接种后，约在第5天小鼠出现肿瘤块，其精神状态良好，毛色洁白，食物摄入量正常。第6～12天，肿瘤增长迅速，小鼠右前肢肿瘤周边脱毛严重，肿瘤周边可见血管，小鼠精神萎靡，食物摄入量减少。第13～20天，部分小鼠肿瘤块有渗血或出血现象。随着时间的延长，小鼠精神恍惚，几乎不进食水。中浓度组接种后，小鼠约在第8天出现肿瘤块，第9～12天，小鼠精神状态尚可，食物摄入量正常，肿瘤生长速度缓慢。第13～20天，小鼠精神状态不如之前，食物摄入量减少，毛色不洁，肿瘤增长速度加快。相对于高、中浓度组，低浓度组肿瘤生长缓慢，小鼠基本情况较好，出现精神不佳、毛色不洁、饮食量减少等情况的时间段推后。原代肿瘤细胞接种小鼠皮下后，约在第3天出现肿瘤块；第4～7天小鼠精神状态尚可，食物摄入量正常，肿瘤生长速度缓慢；第8～20天，小鼠精神状态萎靡，食物摄入量减少，肿瘤块增长速度明显。

3.2 B16細胞接种浓度对肿瘤形成和生长的影响

接种肿瘤细胞浓度的变化，不仅影响着实体瘤显现的时间，同时也影响着成瘤率。选择低、中、高3个浓度组对小鼠肿瘤生长情况进一步考察，其组别间差异P<0.01。不同浓度B16细胞接种小鼠皮下实验结果见表1。

表1数据表明，接种数目越多，肿瘤显现时间越早，成瘤率越高。图1是不同接种浓度条件下，实体瘤体积随时间的变化曲线。图1数据显示：低浓度组肿瘤出现时间最晚，肿瘤生长速度较为缓慢；中剂量组肿瘤生长速度较平稳；高剂量组肿瘤出现时间最早，肿瘤生长速度快。其中，相对于低浓度组，中浓度组肿瘤出现的时间较早，成瘤率能达到80%。同时，中浓度组肿瘤增长的速度较为平稳，更便于考察被测化合物对实体肿瘤增长的影响。对于高浓度组，小鼠肿瘤增长的速度过快，在第18天时肿瘤体积约为4 000 mm3，考虑到动物理论学而放弃，停止实验。所以，确定中浓度组的接种细胞数为最佳接种浓度。

3.3 B16原代细胞与体外培养细胞接种成瘤率的比较

在优选出接种浓度的基础上，进一步对B16原代细胞与体外培养细胞接种成瘤率进行了考察。选取1.0×106个细胞为接种浓度，同时接种于小鼠腋窝皮下，肿瘤显现时间及成瘤率见表2（P<0.01）。

表2数据显示：在给定接种浓度下，体外培养的B16细胞在约第8天出现肿瘤块，成瘤率可达80%。而接种原代细胞后，约在第3天发现肿瘤块，成瘤率可达100%。可见，原代细胞接种成瘤效果优于体外细胞接种。

3.4 最佳接种浓度条件下肿瘤的生长

在最佳接种浓度下，将体外培养的B16细胞和小鼠黑色素瘤原代细胞接种于小鼠皮下，考察实体瘤在两组小鼠体内的生长情况，数据如图2所示。由图2实体瘤增长曲线可知，与接种体外培养B16细胞相比，接种原代细胞的小鼠黑色素实体瘤的生长速度较快，成瘤率较高，但两组的肿瘤生长速度均较为平稳。

3.5 建模方法评价

为了更进一步考察两种模型在药物筛选中应用的可行性以及特点，研究中选择目前临床上使用的抗肿瘤药物紫杉醇测试了所建模型。接种体外培养B16细胞和原代B16细胞于小鼠皮下，按常规选取成瘤后的小鼠，将其随机分为两组，平行各选10只，编号从1到10，腹腔注射紫杉醇。在给药期间，小鼠均没有死亡现象。给药21天后，观察各组小鼠的肿瘤体积大小。考虑到小鼠个体差异性，实验重复3次，结果基本相似，实验数据如图3所示。

由图3可知，紫杉醇能够抑制黑色素瘤的增大，但似乎药物对两组小鼠体内肿瘤抑制的效果存在一定的差异，主要表现为各小鼠实体瘤体积相差较大。其中，原代肿瘤细胞组的各小鼠肿瘤体积相对差异不大，数据平行性较好。相反，体外培养细胞组的各小鼠肿瘤体积大小的波动性较大。药物筛选是一项系统而严谨的研究工作，数据的真实性和稳定性对判定化合物的药用价值十分重要。相对于体外培养细胞模型，原代B16细胞模型在筛选和评价特定化合物的抗肿瘤活性方面，数据误差较小，便于得出相对准确的评价。

4 结 论

1）选用体外培养的B16细胞，在低、中、高3个不同浓度下接种于C57BL/6小鼠皮下，优选出中浓度为优势肿瘤模型的接种浓度。

2）在中浓度基础上，将体外培养的B16细胞和原代肿瘤细胞分别同时接种于小鼠皮下，数据显示，原代细胞的小鼠黑色素实体瘤生长速度较快，成瘤率较高，但两组的肿瘤生长速度均较为平稳。

3）选择紫杉醇药物来评价所建模型的效果，结果显示，两种模型均可应用于药物的筛选，在疗程内未发现有小鼠死亡的现象。但在观察实体瘤的变化时发现，原代细胞肿瘤模型组的小鼠肿瘤体积在施药后21天时，彼此差异相对较小；而在施药计量、施药时间等所有条件相同的情况下，体外培养细胞模型组小鼠的肿瘤体积彼此相差较大。

4）原代B16细胞模型是体内筛选和评价特定化合物抗肿瘤活性的一种可行而有效的方法，成瘤时间较短、成瘤率高，所得实验数据误差也较小，为相关药物评价模型的开发研究提供了一条可借鉴的新途径。

5）本实验只做了小鼠黑色素瘤模型，今后尚需对其他肿瘤模型的建立开展更进一步的研究。

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