沉香样品中曲霉属真菌菌株HNWSW—20的分离鉴定及其次生代谢产物的研究

邓加艾　戴好富　王宇光　陈惠琴　谭志琼　梅文莉

摘 要 本文采用平板分离法从沉香样品中分离得到一株真菌HNWSW-20，从形态学和分子生物学上鉴定其为曲霉菌（Aspergillus sp.），并利用多种色谱技术对其次生代谢产物进行分离纯化，根据波谱数据和理化性质鉴定其化合物结构为：2，3-dihydrosorbicillin（1），sorbicillin（2），2，3-二氢-2-（1-丙烯）-6，8-二甲基-7-羟基-色酮（3），邻苯二甲酸二丁酯（4），7-羟基-异苯并呋喃-1（3H）-酮（5）二十烷酸甲酯（6）；分别采用Ellman比色法和pNPG法测定化合物的乙酰胆碱酯酶抑制活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性，结果显示上述化合物1、2、4具有乙酰胆碱酯酶抑制活性，而化合物1、3、5具有α-葡萄糖苷酶抑制活性。本文中化合物1～2为首次从曲霉属中分离得到，并首次报道具有乙酰胆碱酯酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性。

关键词 沉香；真菌；分离鉴定；次生代谢产物；生物活性

中图分类号 R284.1 文献标识码 A

Abstract The fungus HNWSW-20 from Chinese agarwood was isolated by a plate separation method and identified as Aspergillus sp. by morphology and molecular biology. The secondary metabolites were isolated and purified by various chromatographic technique， and the structures of the compounds were identified as 2，3-dihydrosorbicillin （1）， sorbicillin （2）， （2R）-2，3-dihydro-7-hydroxyl-6，8-dimethyl-2-[（E）-prop-1-enyl] chromen-4-one （3）， dibutylphthalate （4）， 7-hydroxy-1 （3H）-isobenzofuranone （5）， eicosanoic acid （6） on the basis of spectroscopic evidence and physicochemical properties. The acetylcholinesterase and α-glucosidase inhibitory activities of the compounds were determined by Ellman colorimetric assay and pNPG method， respectively. Compounds 1， 2 and 4 showed acetylcholinesterase inhibitory activities， whereas compounds 1， 3 and 5 exhibited α-glucosidase inhibitory activities. In addition， compounds 1–2 were for the first time isolated from Aspergillus sp.， and this was the first report about their acetylcholinesterase and α-glucosidase inhibitory activities.

Keywords Chinese agarwood； fungus； isolation and identification； secondary metabolites； biological activity

DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.08.022

白木香[Aquilaria sinensis （Lour.） Gilg]，又名女兒香、莞香、栈香、土沉香等，为瑞香科（Thymelaeaceae）沉香属（Aquilaria）植物，是我国热带、亚热带地区常绿乔木，也是中国沉香唯一的基源植物，主要分布在海南、广东、福建等地[1]。健康白木香树不产沉香，而是在自然因素（雷劈、火烧、虫蛀等）或人为因素（砍伤、打洞、接菌等）损伤或刺激后，经过长时间的反应变化，逐渐形成沉香。陶弘景的《名医别录》中有：“沉香、熏陆香、鸡舌香、藿香、詹糖香、枫香并微温。”这是作为药物的最早记载。沉香性微温，味辛、苦，归脾、胃、肾经，用于胸腹胀闷疼痛，胃寒呕吐呃逆，肾虚气逆喘急等病症的治疗[2]。沉香燃烧时散发出一股清香味，是许多国家的名贵香料，也常被制成手串等工艺品售卖。

有文献报道[3]，沉香的形成与真菌有关，目前已有不少针对沉香中的真菌进行分离和鉴定的研究。传统的真菌鉴定方法常根据形态的描述来确定种属，这种方法简单直观，但不确定因素过多，易干扰菌种的分类鉴定[4]。随着科学技术的进步，分子生物学也迅猛发展，核酸序列分析成为真菌鉴定的重要手段。内转录间隔区（internal transcribed spacer，ITS）序列分析法就是最常见的鉴定方法之一。ITS基因是位于真菌核糖体DNA上18S和28S基因之间的区域片段，主要含有内转录间隔区1（ITS1）、5.8S rRNA、内转录间隔区2（ITS2）三个片段，长度一般在650～750 bp之间[5]。ITS区域不加入成熟核糖体，所以该片段适应性强，能接受更多的变异，进化速度较快，具有多态性特点。5.8S rRNA基因具有高度保守性，存在着广泛的异种同源性；ITS1和ITS2为中度保守区，其保守性种内几乎相同而种间差异较大。ITS序列分析可以作为真菌鉴定的重要指标[6-8]，结合形态特征等，使菌种鉴定更具有科学性，可信性。

目前，对于沉香样品来源的真菌的次生代谢产物研究以发酵液的抗菌活性为多，对其中活性化合物的分离鉴定尚不多见。本课题组前期对奇楠沉香样品中的真菌进行研究，并通过各种色谱和波谱方法对一株镰刀菌（Fusarium sp.）进行了次生代谢产物的分离鉴定，得到了一系列具有生物活性的化合物[9]。为了广泛研究沉香来源的不同真菌，分析其次生代谢产物的生物活性，本研究对白木香所产沉香中的真菌进行了分离，其中通过形态学和分子生物学鉴定HNWSW-20为曲霉菌（Aspergillus sp.），进而从该菌株的PDB发酵产物的乙酸乙酯萃取物中分离得到了6个化合物，并对化合物进行了乙酰胆碱酯酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性的筛选。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料与试剂 供试沉香样品：购买自广东省化州市平定县，由中国热带农业科学院热带生物技术研究所王军博士鉴定为广东白木香所产沉香。

主要试剂：C18反相硅胶和Sephadex LH-20购于Merck公司，乙酰胆碱酯酶、碘化硫代乙酰胆碱、二硫代二硝基苯甲酸（DTNB）、他克林均购于Sigma公司，α-葡萄糖苷酶购于Solarbio公司；阿卡波糖购于北京百灵威科技有限公司。

1.1.2 培养基 马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂18 g，自来水定容至1 000 mL；马铃薯葡萄糖液体培养基（PDB）：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，自来水定容至1 000 mL。

1.1.3 仪器与设备 Autospec300质谱与AV-500核磁共振波谱仪，德国Bruker公司；Autopol III型旋光仪，德国Rudolph公司；CA-1111冷却水循环装置与SB-1100旋转蒸发，日本EYELA公司；HV-110高压灭菌器，日本Hirayama公司；Multiskan FC酶标仪，美国Thermo Scientific公司；XY-JH-21BC净化工作台，上海昕仪器仪表有限公司；1260分析型HPLC，美国Agilent公司；BP221S万分之一电子秤，北京赛多利斯天平有限公司；CX31光学显微镜，日本OLYMPUS公司。

1.2 方法

1.2.1 HNWSW-20菌株的分离与鉴定 分离：取沉香块，用水冲洗后，浸泡于75%酒精2 min，取出，放入0.1%升汞液中浸泡5 min，取出，用无菌水冲洗3～5遍。将最后一次冲洗液涂布在干净的PDA平板上，作为对照组以检验消毒是否彻底。将处理过的沉香块切成0.5 cm × 0.5 cm的小块，置于PDA平板上（含0.01%的氯霉素），于28 ℃培养箱中培养。待平板上长出菌落，用平板划线法和菌丝顶端纯化法分离纯化菌株。

形态学鉴定：将纯化后的真菌HNWSW-20划线接种到PDA培养基上，然后把灭菌的盖玻片以45度角插入培养基中，放于28 ℃培养箱培养 4 d，等到菌丝体生长出来并附着在盖玻片上时，轻輕地拔出盖玻片，置于显微镜下观察菌丝和孢子的形态。

分子生物学鉴定：提取DNA，以真菌通用引物（ITS1：TCCGTAGGTGAACCTGCGG与ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC）进行PCR扩增，并对PCR扩增所得产物进行纯化后，送往生物工程（上海）股份有限公司测序，测序结果提交于NCBI基因库，进行同源性比对。

1.2.2 HNWSW-20菌株发酵 将真菌HNWSW- 20于PDA平板上进行活化后，取1 mm × 1 mm大小的菌块，放入500 mL的三角瓶（含150 mL PDB培养基）中，于28 ℃，150 r/min条件下振荡培养3 d，获得种子液。取5 mL种子液接种于1 000 mL三角瓶（含400 mL PDB培养基）中，常温下静置培养50 d，共发酵120瓶。

1.2.3 HNWSW-20菌株次生代谢产物的提取与分离纯化 将每瓶发酵液1：1加入乙酸乙酯，混匀，用Bruker FA25匀浆机破碎菌丝细胞与孢子，三层纱布过滤，取滤液，用乙酸乙酯1：1萃取三遍，回收合并乙酸乙酯层，减压浓缩，获得乙酸乙酯提取物（37.0 g）。

将乙酸乙酯提取物经过减压硅胶柱色谱，以石油醚-氯仿、氯仿-甲醇为流动相，进行梯度洗脱，得到13个流份（Fr.1～Fr.13）。Fr.4（126.0 mg）经Sephadex LH-20凝胶柱色谱分离（流动相为甲醇），得到Fr.4-1和Fr.4-2两个流份。Fr.4-1（110.5 mg）再经过Sephadex LH-20凝胶柱色谱洗脱（流动相为氯仿-甲醇，体积比为1：1），再经半制备HPLC分离（流动相为甲醇-水，体积比为70：30），得到化合物4（8.1 mg）。Fr.4-2（12.0 mg）经半制备HPLC分离（流动相为甲醇-水，体积比为70：30），得到化合物1（4.2 mg）。Fr.5（1.0 g）以甲醇-水为流动相，经C18柱色谱梯度洗脱，得到9个流份（Fr.5-1～Fr.5-9）。Fr.5-2（9.2 mg）经Sephadex LH-20凝胶柱色谱分离（流动相为氯仿-甲醇，体积比为1：1），得到Fr.5-2-1和Fr.5-2-2两个流份。Fr.5-2-2（5.2 mg）经半制备HPLC分离（流动相为甲醇-水，体积比为25：75），得到化合物5（1.2 mg）。Fr.5-4经半制备HPLC分离（流动相为甲醇-水，体积比为60：40），得到化合物3（5.2 mg）。Fr.5-6经Sephadex LH-20凝胶柱色谱分离（流动相为氯仿-甲醇，体积比为1：1），得到化合物2（4.0 mg）。Fr.5-9以石油醚-氯仿为流动相梯度洗脱，经硅胶柱色谱分离，得到化合物6（43.5 mg）。

1.2.4 生物活性测试 乙酰胆碱酯酶抑制活性测试：使用Ellman等[10]的方法测定化合物对乙酰胆碱酯酶的抑制活性，DMSO为溶剂，他克林为阳性对照，阴性对照为DMSO。计算公式如下：

抑制率= （A0–A1）/A0，

式中，A0表示阴性对照平均吸光值，A1表示待测样品的平均吸光值。

α-葡萄糖苷酶抑制活性测试：根据Jong- Anurakkun等[11]报道的pNPG（4-硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷）法对化合物进行α-葡萄糖苷酶抑制活性的评价。以阿卡波糖溶液为阳性对照，DMSO-PBS溶液（10%）为阴性对照。计算公式如下：

抑制率= [（B1–B0） –（A1–A0）]/（B1–B0）×100%

式中，A0表示背景对照组吸光值，A1表示实验组吸光值，B0表示空白对照组吸光值，B1表示阴性对照组吸光值。

2 结果与分析

2.1 真菌HNWSW-20的鉴定

形态学鉴定：PDA培养基上菌落呈圆形，中间略凸，初为白色，后渐变为白绿色，菌落反面为淡黄色。分生孢子梗细长，顶端膨大形成球状顶囊，分生孢子为球形，于顶囊处呈串状生长。菌株HNWSW-20的形态学特征与文献[7]中关于曲霉属（Aspergillus sp.）的形态描述相似。

分子生物学鉴定：所得序列在NCBI上进行BLAST比对后，用MEGA6.06软件构建系统发育树，如图2所示。结果显示，HNWSW-20菌株与曲霉菌最为接近，且其与烟曲霉（Aspergillus fumigatus）DYJ1（1）菌株（登录号为KM268635）同源性高达100%。

综合形态学和分子生物学的结果，将HNWSW- 20菌株鉴定为曲霉属（Aspergillus sp.）菌株。

2.2 化合物的结构鉴定

化合物1：黄色粉末，ESI-MS在m/z 233处给出[M-H]-峰，结合NMR谱数据推断其分子式为C14H18O3。1H-NMR （CD3OD， 500 MHz） δH： 7.44 （1H， s， H-6）， 5.48 （2H， m， H-4'， 5'）， 2.94 （2H， t， J = 7.5 Hz， H2-2'）， 2.34 （2H， m， H2-3'）， 2.14 （3H， s， H3-8）， 2.04 （3H， s， H3-7）， 1.61 （3H， m， H3-6'）； 13C-NMR （CD3OD， 125 MHz） δC： 206.0 （C-1'）， 162.5 （C-2）， 162.0 （C-4）， 131.0 （C -4'）， 130.4 （C-6）， 126.8 （C-5'）， 117.2 （C-5）， 113.4 （C-3）， 111.9 （C-1）， 38.7 （C-2'）， 29.0 （C-3'）， 18.1 （C-6'）， 16.4 （C-8）， 8.0 （C-7）。以上数据与范国涛[12]报道的化合物2'，3'-dihydrosorbicillin的数据基本一致，确定化合物1为2'，3'-dihydrosorbicillin。

化合物2：黄色粉末，ESI-MS在m/z 231处给出[M-H]-峰，结合NMR谱数据推断其分子式为C14H16O3。1H-NMR （CDCl3， 500 MHz） δH： 13.58 （1H， s， 2-OH）， 7.46 （1H， dd， J = 14.7， 10.6 Hz， H-3'）， 7.44 （1H， s， H-6）， 7.44 （1H， s， H-6）， 6.94 （1H， s， H-2'）， 6.31 （2H， m， H-4'， 5'）， 2.22 （3H， s， H3-8）， 2.14 （3H， s， H3-7）， 1.91 （3H， d， J = 6.4 Hz， H3-6'）； 13C-NMR （CDCl3， 125 MHz） δC： 192.7 （C-1'）， 162.7 （C-2）， 158.7 （C-4）， 144.6 （C-3'）， 141.3 （C-5'）， 131.0 （C-4'）， 128.9 （C-6）， 122.0 （C-2'）， 114.5 （C-5）， 113.7 （C-3）， 110.5 （C-1）， 19.1 （C-6'）， 15.8 （C-8）， 7.7 （C-7）。根据以上数据分析，结合文献[13]，化合物2被鉴定为sorbicillin。

化合物3：无色粉末，[α]20 D = -20.4 （c 0.26， MeOH）；ESI-MS在m/z 255处给出[M+Na]+峰，结合NMR谱数据推断其分子式为C14H16O3。1H-NMR （CDCl3， 500 MHz） δH： 7.56 （1H， s， H-2）， 5.87 （1H， dq， J = 15.4， 6.5 Hz， H-5'）， 5.70 （1H， ddd， J = 15.4， 6.3 Hz， 1.5 Hz， H-4'）， 4.85 （1H， m， H-3'）， 2.69 （2H， m， H-2'）， 2.20 （3H， s， H-7）， 2.13 （3H， s， H-8）， 1.77 （3H， d， J = 6.5 Hz， H-6'）； 13C-NMR （CDCl3， 125 MHz） δC： 191.9 （C-1'）， 159.6 （C-6）， 158.9 （C-4）， 129.9 （C-5'）， 129.0 （C-4'）， 125.9 （C-2）， 117.3 （C-3）， 114.6 （C-1）， 110.7 （C-5）， 78.3 （C-3'）， 42.8 （C-2'）， 18.0 （C-6'）， 15.5 （C-7）， 8.2 （C-8）。以上数据与Ying等[14]报道的化合物2的数据基本一致，确定化合物3为2，3-二氢-2-（1-丙烯）-6，8-二甲基-7-羟基-色酮。

化合物4：无色油状，ESI-MS在m/z 279处给出[M+H]+峰，结合NMR谱数据推断其分子式为C16H22O4。1H-NMR （CD3OD， 500 MHz） δH： 7.72 （2H， dd， J = 5.7， 3.3 Hz， H-3， 6）， 7.61 （2H， dd， J = 5.7， 5.7 Hz， H-4， 5）， 4.29 （4H， t， J = 6.6 Hz， H-8， 8'）， 1.72 （4H， dt， J = 6.6， 14.5 Hz， H-9， 9'）， 1.45 （4H， m， H-10， 10'）， 0.98 （6H， t， J = 7.4 Hz， H-11， 11'）； 13C-NMR （CD3OD， 125 MHz） δC： 169.3 （C-7， 7'）， 133.6 （C-1， 2）， 132.3 （C-4， 5）， 129.9 （C-3， 6）， 66.6 （C-8， 8'）， 31.7 （C-9， 9'）， 20.3 （C-10， 10'）， 14.0 （C-11， 11'）。以上數据与曹煦等[15]报道的化合物5的数据基本一致，确定化合物4为邻苯二甲酸二丁酯。

化合物5：白色粉末，ESI-MS在m/z 173处给出[M+Na]+峰，结合NMR谱数据推断其分子式为C8H6O3。1H-NMR （CDCl3， 500 MHz） δH： 7.57 （1H， t， J = 7.8 Hz， H-5）， 6.98 （1H， d， J = 7.8 Hz， H-4）， 6.94 （1H， d， J = 7.8 Hz， H-6）， 5.33 （2H， s， H2-3）； 13C-NMR （CDCl3， 125 MHz） δC： 172.7 （C-1）， 156.6 （C-7'）， 146.7 （C-7）， 137.0 （C-5）， 115.3 （C-4）， 113.4 （C-6）， 110.9 （C-3'）， 70.7 （C-3）。根据以上数据析，结合文献[16]，化合物5被鉴定为7-羟基-异苯并呋喃-1（3H）-酮。

化合物6：白色固体，在m/z 255处给出[M+Na]+峰，结合NMR谱数据推断其分子式为C21H42O2。1H-NMR （CDCl3， 500 MHz） δH： 3.64 （3H， s， H3-21）， 2.28 （2H， t， J = 7.6 Hz， H-2）， 1.59 （2H， m， H-3）， 1.29 （32H， m， H-4～H-19）， 0.86 （3H， t， J = 6.9 Hz， H-20）； 13C-NMR （CDCl3， 125 MHz） δC： 174.37 （C-1）， 51.5 （C-21）， 34.2 （C-2）， 32.0 （C-18）， 28.8～29.8 （C-4～C-17）， 25.1 （C-3）， 22.8 （C-19）， 14.2 （C-20）。以上數据与朱少晖等[17]报道的二十烷酸甲酯的数据基本一致，故鉴定化合物6为二十烷酸甲酯。

2.3 生物活性测试结果

2.3.1 乙酰胆碱酯酶抑制活性 化合物1～4乙酰胆碱酯酶抑制活性结果如表1所示。其中化合物1～3为首次检测乙酰胆碱酯酶抑制活性。从表中可以看出，化合物1、2、4具有较弱的乙酰胆碱酯酶抑制活性，化合物3未检测到乙酰胆碱酯酶抑制活性。

2.3.2 α-葡萄糖苷酶抑制活性 化合物1～5 对α-葡萄糖苷酶抑制活性结果如表2所示。其中化合物1～3为首次检测α-葡萄糖苷酶抑制活性。从表中可以看出，化合物1、3具有较强的α-葡萄糖苷酶抑制活性，其活性比阳性对照他克林略高，化合物5具有微弱的α-葡萄糖苷酶抑制活性，化合物2、4未检测到α-葡萄糖苷酶抑制活性。

3 讨论

本研究从沉香中分离纯化得到一株真菌HNWSW-20，鉴定为曲霉菌（Aspergillus sp.）。并对其PDB发酵后的次生代谢产物进行研究，共得到6个化合物，根据波谱数据分析，分别鉴定为2，3-dihydrosorbicillin（1），sorbicillin（2），2，3-二氢-2-（1-丙烯）-6，8-二甲基-7-羟基-色酮（3），邻苯二甲酸二丁酯（4），7-羟基-异苯并呋喃-1（3H）-酮（5），二十烷酸甲酯（6），其中化合物1～2为首次从曲霉属中分离得到。

化合物1～3为首次检测乙酰胆碱酯酶抑制活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性。α-葡萄糖苷酶可限制或延缓糖在消化道内分解，α-葡萄糖苷酶抑制剂是Ⅱ型糖尿病降糖药之一，在临床上广泛使

用[18]。本研究中化合物1、3具有较强的α-葡萄糖苷酶抑制活性，其活性比阳性对照他克林略高，化合物5具有弱的α-葡萄糖苷酶抑制活性，可为研制新的α-葡萄糖苷酶抑制剂提供思考线索。此外化合物1、2、4具有弱的乙酰胆碱酯酶抑制活性。

有学者认为沉香的形成是由于其基源植物受伤后经微生物侵染，出现一系列病理症状，植株经过刺激反应，逐渐分泌防御性树脂形成沉香。张秀环等[19]证明白木香健康部位和树脂形成部位的内生真菌优势种群不同，分别为枝顶孢霉属（Acremonium sp.）和青霉属（Penicillium sp.）。马华明[20]通过实验表明沉香始形成和已形成两阶段的菌种相似，以可可毛壳色单隔孢（Lasiodiplodia theobromae）等致病菌为主，但与沉香未形成阶段分离到的菌种有很大差异。更有研究[21]证明多变根毛霉（Rhizomucor variabilis）、再育镰刀菌（Fusarium proliferatum）和哈茨木霉（Trichoderma harzii）能促进沉香的形成。由此说明，沉香结香与真菌存在一定相关性。沉香中富含色酮类化合物[22-24]，本研究所分离得到的化合物1～5均带有苯环，且化合物1～3为结构相似的系列化合物，化合物3成环后形成了色酮的母核结构。本菌株的次生代谢产物与沉香中色酮衍生物的形成是否具有相关性，还有待进一步研究。

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