茉莉酸甲酯重复刺激对白木香所结沉香中沉香四醇含量的研究

江浩 王祝年 羊青 王清隆 王茂媛

摘 要 利用茉莉酸甲酯，重复刺激诱导白木香结香，提高所结沉香中沉香四醇的含量。白木香经锯伤、及3种浓度（0、10、50 g/L）茉莉酸甲酯重复刺激（仅1次、1次/月、2次/月、4次/月）诱导结香，时长6个月，HPLC法测定所结沉香中沉香四醇的含量。结果表明：10 g/L茉莉酸甲酯2次/月刺激诱导白木香所结沉香中沉香四醇含量最高，为1.78 mg/g。由此可知，利用植物激素茉莉酸甲酯诱导、重复刺激均能明显提高白木香所结沉香中沉香四醇的含量。

关键词 白木香；结香；茉莉酸甲酯；刺激；沉香四醇

中图分类号 R284 文献标识码 A

Abstract Methyl jasmonate was used to stimulate repeatedly Aquilaria sinensis to form agarwood which has high content of agarotetrol. Agarwood was induced by sawing or three concentrations （0， 10， 50 g/L） of methyl jasmonate， then repetitive stimulation （only once， once per month， twice per month， 4 times per month） for 6 months. The HPLC method was used to determine the content of agarotetrol in the agarwood. The result showed that the content of agarotetrol in the agarwood of A. sinensis treated twice per month with 10 g/L of methyl jasmonate was the highest， 1.78 mg/g. In conclusion， phytohormone methyl jasmonate and repeated stimulation are beneficial to increasing the content of agarotetrol in the agarwood of A. sinensis.

Keywords Aquilaria sinensis； agarwood formation； methyl jasmonate； stimulation； agarotetrol

DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.09.023

沉香是瑞香科（Thymelaeaceae）沉香屬（Aquilaria Lam.）和拟沉香属（Gyrinops Gaertn.）植物中含有其自身分泌树脂的干燥木材[1]，其性辛、苦，微温，归脾、胃、肾经，行气止痛，温中止呕，纳气平喘[2]。白木香[Aquilaria sinensis （Loureiro）Sprengel]是国产沉香特有的结香树种和唯一来源。随着中药现代化的快速发展和香客、收藏爱好者对沉香的热衷，沉香的需求日益增加，野生资源和传统的人工结香已经远远不能满足需求，探索高效益的结香技术迫在眉睫[3-5]。如今，白木香人工栽培技术日渐成熟[6]，华南地区有大面积白木香栽培基地，如海南岛的海口、临高、定安、乐东尖峰岭以及昌江霸王岭等地区，每年人工育苗可达几百万株[7]。

白木香正常生长，未受到任何刺激和创伤，木材内部无法产生树脂。自然生长的白木香树经过虫蚁的啃食、病腐、风倒、雷击和火烧等外来因素伤害之后，在受伤害部位细胞内部会出现棕黄色脂类物质，常年积累产生含脂量较高的沉香。茉莉酸类化合物调节植物的生长和发育，特别是作为内源伤害信号分子参与植物对生物胁迫（真菌或细菌侵染及昆虫啃食）防御反应和对非生物胁迫（伤害、盐胁迫、高温、低温、水淹、干旱等）逆境的应答[8]。张争等[9]研究证明，伤害导致白木香防御反应中早期伤害信号内源茉莉酸类化合物含量升高，随后倍半萜类防御物质含量增高，而外源茉莉酸甲酯的处理也能诱导白木香产生相同种类的倍半萜类物质且数量远远高于伤害。

对于白木香结香原理的研究，国内的学者多集中在真菌诱导白木香结香[10-11]，白木香叶、果实、茎等部位的化学成分研究[12-14]以及白木香结香树脂部位主要成分研究[15-16]；国外学者多集中在沉香结香机制及主要成分的形成，如Kurosaki等[17]从小果沉香（A. microcarpa Baill.）细胞培养体系中分离到3个编码倍半萜合酶基因，参与催化α-愈创木烯合成酶、δ-愈创木烯合成酶、β-榄香烯和α-蛇麻烯等倍半萜烯的生物合成；Azzarina等[18]从马来沉香（A. malaccensis Lam.）中克隆得到倍半萜合酶编码基因AmSesTPS1和δ-愈创木烯合酶编码基因AmGuaiS1。目前，利用植物激素结合重复刺激诱导白木香结香的造香技术鲜有报道。本研究拟通过茉莉酸甲酯结合凿洞法重复刺激诱导白木香结香，以期提高所结沉香中沉香四醇的含量，缩短结香时间。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料 植物材料白木香来自海南省儋州国家农业科技园区基地10年生的健壮白木香树（10棵，编号1～10），经中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所王祝年研究员鉴定为瑞香科沉香属白木香。

1.1.2 仪器与试剂 Agilent-1260型高效液相色谱仪，美国安捷伦公司；KQ-600DE型数控超声波清洗器，昆仑超声仪器有限公司；AE-240型电子天平，瑞士梅特勒-托利多公司；ZORBAX 色谱柱XDB-C18，美国安捷伦公司；电热鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司。

茉莉酸甲酯（MJ），西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司，批号MKBZ8786V；为减少茉莉酸甲酯的损失，另选医用脱脂棉作为香门的填充体，脱脂棉在使用之前放入烘箱干燥处理；一次性无菌注射器（30 mL），购自江西益康医疗器械集团有限公司。沉香四醇对照品（批号：Z08J7X15899，纯度≥98%），购自上海源叶生物科技有限公司。乙腈（色谱纯），购自美国Fisher公司，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 白木香刺激结香处理 在白木香树干平整的表面上，距离地面50 cm处自下而上做8个标记，分别为A～H，相邻2个标记相隔30 cm。

阳性对照（1～2号树），用锯子在树体标记处锯成深3 cm、长15 cm的伤痕（图1-a）。阴性对照（3～4号树）及实验组（5～10号树），用锤凿刀等工具在树体标记处开成宽×高×深为3 cm×3 cm× 7 cm的香门（图1-b）。

1～2号树体刺激时使用锯子加深伤痕，达到重复伤害的效果；3～10号树体给药前用镊子夹出脱脂棉，再用刀片清理香门，塞入2.5 g脱脂棉，注射器注射给药20 mL，具体处理如表1所示。

1.2.2 试样采集与预处理 选择晴朗多云的天气，在白木香刺激结香处理的第7个月月初采集样品。为减少取样对测试结果的影响和对植株的伤害，采用双线法取样，具体操作为：

用镊子夹出脱脂棉，再用小刀片轻轻刮去香门周围残留的杂物；选定结香位置，用小刀在距香门上下1.2、3 cm处各划出1条水平切割线（共4条），距香门左右1.5 cm处各划出1条竖直切割线，深度达到木质部，去除韧皮部；用锤凿刀等工具分别取出香门上下2条线之间含树脂的（带颜色）木材，65 ℃烘干，粉碎過60目筛备用。

1.2.3 沉香四醇的含量测定 取含树脂部分木材（主要以颜色区分），去除白色部分，采用《中华人民共和国药典》中的高效液相色谱法（通则0512）测定沉香中沉香四醇的含量[19]。

对照品溶液的制备：精确称取一定量的沉香四醇对照品，加95%乙醇配制成60 ?g/mL的对照品溶液。

供试品溶液的制备：精确称取沉香干燥粉末0.2 g，置具塞三角瓶，使用10 mL移液枪精确加入95%乙醇10 mL，记录质量为m，静置0.5 h后，通过超声仪器不加热处理（功率250 W，频率40 kHz） 1 h，冷却后，再确定其质量，用95%乙醇补充至m，并充分混合后静置使其沉淀，取上清液过滤后作为供试品溶液。

色谱条件：流动相 A为乙腈，流动相B为0.1%甲酸水溶液，洗脱时间35 min；按表2设定的配比进行洗脱；柱温为30 ℃；检测波长为252 nm。理论塔板数按所测物质计算应高于6 000。每次进样量10 μL。

1.2.4 方法学考察 线性关系考察：精确吸取一定量的对照品溶液，按差异性配比分别加入95%乙醇制成2、20、40、60、80、100、120 ?g/mL的对照品溶液。按顺序精确吸取上述对照品溶液10 ?L进样，以峰面积（y）对浓度（x，?g/mL）做标准曲线。

精密度试验（RSD值小于2.0%）：精确吸取对照品溶液3 mL，置于10 mL棕褐色容量瓶中，加95%乙醇稀释至刻度，摇匀。连续进样6次，记录沉香四醇峰面积，并计算RSD。

稳定性试验（RSD值小于2.0%）：精确称取干燥样品0.2 g，配制供试品溶液，常温搁置，分别在同一天0、2、4、6、8、10、12、24 h准时进样，记录沉香四醇的峰面积，并计算RSD。

重复性试验（RSD值小于2.0%）：精确称取干燥样品0.2 g，配制供试品溶液，进样，记录沉香四醇的峰面积，重复操作6次，并计算RSD。

回收率试验：精确称取干燥样品0.2 g 6份，平均分为3组，每组分别加入沉香四醇对照品0.513 4、0.661 2、0.813 2 mg，配制供试品溶液，进样，记录沉香四醇的峰面积，并计算RSD；计算平均加样回收率。

1.3 数据处理

使用WPS软件进行数据处理及分析。

2 结果与分析

2.1 木质部形态特征

将取好的含树脂的木材擦干净，观察木材形态特征。由表3和图2可知，阳性对照组沉香由锯子锯伤所形成，伤口表面全部结香，伤口颜色由内向外逐渐由黄加深，最外面黑褐色（由于长期裸露在外腐烂形成）。阴性对照组及实验组沉香由凿洞法结合药剂处理形成，以洞为中心，呈椭圆形。形成方向以竖直为主，高度能达到11～ 15 cm；水平方向形成少，宽4～5 cm，长7～8 cm。伤口表面均为黑褐色，内部沉香颜色为黄色，黄褐色。

2.2 HPLC法分析沉香四醇含量

采用HPLC法分析沉香中沉香四醇的含量，图3为对照品和样品的液相色谱图。方法学考察的结果表明，在2.0～120 ?g/mL范围内，沉香四醇回归方程y=29.502x+1.254 8，相关系数R2=0.999，线性关系良好。精密度试验结果表明该设备有很好的精密性，相对标准偏差RSD为0.68%。稳定性试验表明，常温下供试品溶液在全天内有很好的稳定性，相对标准偏差RSD为1.03%。该方法重复性良好，相对标准偏差RSD为1.37%。平均加样回收率为102.42%，RSD为1.02%，表明回收率很好，符合检测方法要求。

2.3 茉莉酸甲酯对白木香诱导效果评价

根据《中华人民共和国药典》[19]，以沉香 四醇为标准评价沉香品质，沉香四醇（C17H18O6）的含量应大于0.10%（以干燥样品总量计算）。 因此，本研究中16种处理方式，其中5种处理 （10 g/L茉莉酸甲酯刺激1、2、4次/月及50 g/L茉莉酸甲酯刺激1、2次/月）所结沉香质量合格（表4）。

比较实验组1、2与阳性对照白木香所结沉香中沉香四醇的含量可知，茉莉酸甲酯诱导白木香效果良好。其中实验组1，给药浓度为10 g/L茉莉酸甲酯乙醇溶液，刺激频次2次/月所结沉香四醇含量最高，为1.78 mg/g，是对应阳性对照的14.8～ 21.8倍，有显著提高沉香四醇含量的效果。

比较实验组1与实验组2沉香四醇含量，浓度为10 g/L的茉莉酸甲酯乙醇溶液诱导白木香所结沉香的沉香四醇的含量高于50 g/L浓度，表明茉莉酸甲酯的浓度与其诱导结香的沉香四醇含量不成正比。这可能与植物激素本身的性质有关，植物激素是由植物自身代谢产生的一类有机物质，并从产生部位移动到作用部位，在极低浓度下就有明显生理效应的微量物质，也被称为植物天然激素或植物内源激素[20]。

比较阴性对照与阳性对照及实验组1、2沉香四醇含量，50%浓度的乙醇溶液对白木香结香也有一定的促进作用，可能与50%浓度的乙醇溶液对细胞的伤害诱导白木香结香，但没有茉莉酸甲酯效果好。

2.4 刺激频次对白木香诱导效果评价

比较4个处理组不同刺激频次诱导白木香所结沉香的沉香四醇含量（表4）可知，重复刺激能明显提高沉香四醇的含量，每月2次的刺激方式所结沉香中沉香四醇含量最高，是仅一次的2.8～3.4倍；3种重复刺激方式，2次/月最高，其次1次/月，4次/月最低。白木香结香是一个缓慢的过程，过于频繁的伤害白木香可能造成了其“伤害疲劳”，扰乱了结香生理，反而不利于结香。

3 讨论

本研究表明，白木香树脂类物质不但可由传统的物理创伤、真菌侵染等诱导产生，而且可由茉莉酸甲酯诱导产生，且与物理创伤法、真菌侵染法和通体结香法[21-23]相比，茉莉酸诱导结香效率更高，结香体积更大。茉莉酸甲酯通过白木香树的木质部进入植株体内，在细胞质中被酯酶水解为茉莉酸，激活植株体内茉莉酸信号途径，模拟物理创伤、真菌侵染等效果，最终达到白木香树内脂类物质形成的目的[24]。因此，茉莉酸甲酯可能与白木香树脂类物质的产生有关。当白木香树遭受昆虫取食和特定病原菌侵染时，植株体内茉莉酸、乙烯信号途径会被激活，此信号途径的末端产物会激活白木香体内编码防御蛋白和某类特定基因的表达，随后产生并积累棕黄色脂类物质这类次生代谢产物用于适应环境的胁迫。

近年来，越来越多的学者开始关注植物激素调控植物次生代谢的作用，而除了茉莉酸甲酯，其他如水杨酸、乙烯等对白木香结香品质的调控有待进一步研究；而多次给药刺激这一方式有显著提高沉香四醇含量的效果。但其机制尚未明确，对其他药用植物有效成分的产量及品质是否有一定的提高，亦值得进一步研究。研究白木香的结香机理，探寻新型高效结香方法，对缩短结香时间，提高沉香的单位产量、结香品质，增加白木香林的经济效益，缓解沉香供求关系以及保护和利用白木香资源都有着非常重要的意义。

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