基于ITS及GPD序列分析对贵州紫花菌的分类鉴定

董芳 张传博 吴石平

摘 要 明确贵州省紫花菌分类地位，对其人工驯化、加工及活性物质开发利用提供理论支撑。在贵州4个具有代表性的紫花菌产地附近的农贸市场，收集紫花菌样本进行组织分离，利用形态学结合分子系统学的方法进行鉴定。通过分离纯化获得20株菌株，根据子实体形态特征，在贵州市场收集的紫花菌主要分为两类，一类形态特征与鲜艳乳菇（Lactarius vividus）一致，另一类形态特征与红汁乳菇（L. hatsudake ）一致。基于ITS和GPD基因序列的遗传距离和系统发育分析，显示分离获得的15株菌株与鲜艳乳菇（L. vividus）的遗传距离为0，在系统发育树上以较高的自举支持率与鲜艳乳菇（L. vividus）聚为一支，将15株菌株鉴定为鲜艳乳菇（L. vividus）；5株菌株与红汁乳菇（L. hatsudake）的遗传距离为0，在系统发育树上与红汁乳菇（L. hatsudake）聚为一支，自举支持率为100%，将5株菌株鉴定为红汁乳菇（L. hatsudake）。笔者在贵州市场上收集到的紫花菌中没有鉴定出松乳菇（L. deliciosus），可能与近年松乳菇采集过度或因环境改变导致其发生量减少有关，也有可能是松乳菇与鲜艳乳菇、红汁乳菇形态较为接近，不易区分导致错误鉴定有关。

关键词 紫花菌；鲜艳乳菇；红汁乳菇；多基因系统发育分析

中图分类号 Q939.5 文献标识码 A

Abstract Tissue isolation of specimens collected from 4 representative zihuajun producing areas near the agricultural commodities market in Guizhou were used to identify the taxonomic status of Zihuajun by morphology and molecular phylogeny. Twenty strains were obtained by separation and purification. Zihuajun were mainly divided into two categories according to morphological characteristics of the sporophore. One of the morphological features was consistent with Lactarius vividus； and another kind of morphological characteristics was consistent with L. hatsudake. Based on the genetic distance and phylogenetic analysis of ITS and GPD gene sequences， it showed that the genetic distance between 15 strains and L. vividus was 0. On the phylogenetic tree， a higher bootstrap support rate with L. vividus were clustered into one branch， and the 15 strains were identified as L. vividus. The genetic distance between the other 5 strains and L. hatsudake was 0. On the phylogenetic tree， they were clustered together with L. hatsudake， and the bootstrap support rate was 100%， and the 5 strains were identified as L. hatsudake. No L. deliciosus among Zihuajun collected in Guizhou markets was identified. It may be related to the excessive collection of L. deliciosus in recent years or less due to environmental changes. It is also possible that L. deliciosus is closer to the morphology of L. vividus and L. hatsudake， and is not easy to distinguish， resulting in erroneous identification.

Keywords Zihuajun； Lactarius vividus； Lactarius hatsudake； multiple gene phylogenetic analysis

DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.09.017

紫花菌一般被认为是松乳菇（Lactarius delicious （L.） Gray）的别称[1-2]，或作为松乳菇（L. deliciosus）中紫铜色松乳菇的别名[3-5]，系红菇科，乳菇属，是我国西南地区常見野生食用菌之一，其脆嫩可口、味道鲜美、营养丰富，深受当地人民喜爱；紫花菌还具有抑制肿瘤、抗菌消炎等作用[6]，是一种极具开发价值的食（药）用菌。该菌也是贵州等地乳菇属的主要野生菌。笔者调查发现贵州市场上出售的紫花菌与松乳菇形态特征有一定差异，准确鉴定贵州野生紫花菌，对紫花菌的野生抚育、人工驯化、加工及活性物质开发利用具有重要意义。李河等[7]利用ITS（internal transcribed spacer，核糖体内转录间隔区）序列将湖南省2类乳菇属贸易种鉴定为松乳菇和半血红乳菇（L. semisanguifluus）。Nuytinck等[8]曾用以ITS序列和GPD（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogease，甘油醛-3-磷酸脱氢酶）序列为基础的分子系统进化分析方法对乳菇属全球范围内的38个种进行系统分类。杨祥开等[9]基于ITS序列对红汁乳菇组织分离菌株进行分子鉴定。Wang等[10]以鲜艳乳菇子实体为鉴定材料，采用形态学结合分子系统学进行研究。赵辉等[11]利用ITS序列鉴定出组织分离菌株为鲜艳乳菇（L. vividus）。研究结果表明分子系统学结合形态学特征对乳菇属进行分析，结果可靠、准确。本实验采用形态学结合基于ITS和GPD等2个基因序列的多基因系统发育分析方法对从贵州4个具有代表性的紫花菌产地农贸市场收集的紫花菌分离获得的20株菌株进行鉴定，明确贵州省紫花菌的分类地位，从而为其人工驯化、加工及活性物质开发利用提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

分别于2016年7—11月从贵州安顺、江口、开阳、花溪等具有代表性的紫花菌产地的农贸市场收集紫花菌，根据形态特征，将收集到的紫花菌进行归类，每一类选取菌盖完整、菌褶完好，没有腐烂的新鲜子实体，进行组织分离，子实体样本信息见表1。主要试剂：2× Taq PCR MasterMix和基因组DNA提取试剂盒购自天根（北京）生化科技有限公司、引物由捷瑞（上海）生物工程有限公司合成，其他生化试剂购自生工生物工程（上海）股份有限公司。

培养基：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂15 g、蒸馏水1 000 mL、马尾松土壤浸出液200 mL（马尾松土壤20 g，蒸馏水200 mL，煮沸过滤），高压蒸汽灭菌锅中121 ℃灭菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 菌株的获得 参考食用菌组织分离法[12]，并做适当修改。紫花菌子实体用75%的酒精进行消毒，在超净工作台内，用手从菌盖中间将子实体一分为二，用注射器的针头分别在菌盖内侧及菌盖和菌柄交界处的断面挑取3 mm×3 mm的组织块，接种到上述培养基中。每个子实体接种4个组织块，于26 ℃下避光培养7 d，注意每天观察菌丝生长情况，及时将污染的杂菌剔除。当菌落达到1 cm左右时可转接到新培养基中进行纯化培养。

1.2.2 菌丝DNA的提取 从供试菌落上收集菌丝，加液氮研磨成粉末状后，用基因组DNA提取试剂盒（TIANGEN DP305）提取菌丝基因组DNA。

1.2.3 引物选择 ITS基因片段参照Michael等[13]设计的引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGC GG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATAT GC-3′）引物。GPD基因片段采用Kreuzinger等[14]设计的引物CTK-132re（5′-GTCTACATGTTCAAG TACGACTC-3′）和CTK-133rev（5′-CCGATGAAG TCAGTTGACACTAC-3′）。

1.2.4 PCR扩增及测序 PCR反应体系（30 μL）：2× Taq PCR MasterMix 15 μL，10 μmol/L引物各0.5 μL，模版DNA 1 μL，ddH2O 13 μL。ITS扩增程序：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共35个循环；72 ℃延伸5 min。GPD扩增程序：95 ℃预变性90 s，95 ℃变性45 s，54 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，共40个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物送至北京赛诺基因有限公司测序。

1.2.5 遗传距离分析 运用MAFFT软件对分离获得菌株的ITS与GPD序列以及在GenBank中3种乳菇的ITS与GPD序列进行对齐[15]。为实现排列对齐匹配的最优化，采用手动进行校正，将对齐后的ITS和GPD基因序列连接成多基因序列。根据序列相似性将本次试验所测的20株菌株进行分组，序列完全一致的归为一组，每组选取1株菌株的多基因序列与GenBank中3种乳菇的多基因序列利用MEGA6软件计算遗传距离。

1.2.6 PCR扩增产物序列分析 在NCBI数据库上对扩增产物序列进行比对，初步确定紫花菌的分类地位。从GenBank中下載模式菌株或重要菌株的ITS和GPD基因参考序列（表2）；参照1.2.5节的方法将相关序列进行对齐，利用DAMBE（v5.3.70）对序列替换颠换饱和度进行测定[16]，通过Gblocks（v0.91b.）提取保守的、比对结果好的区域，运用Paup* 4.0 beta 10软件以最大简约法（maximum parsimony，MP）进行系统发育分析[17]。

2 结果与分析

2.1 紫花菌形态特征观察

贵州市场上收集到的紫花菌品种主要为两类。第一类：子实体橙色，颜色鲜艳，菌盖扁半球形，表面光滑，中央有凹陷，有同心环纹，菌盖边缘内翻，厚而整齐。菌肉幼时橙黄色，伤后变浅绿色。菌褶与菌盖同色，稍密，老后变绿色。菌柄近圆柱形，表面有蓝绿斑，内部中空，浅橙色，该类型紫花菌与鲜艳乳菇的形态一致（图1-A）。第二类：子实体黄褐色，菌盖扁半球形，表面有蓝绿斑，中央脐凸，同心环纹不明显，菌盖边缘幼时内卷，后平展。菌肉幼时淡紫色，伤后变蓝绿色。菌褶密，分叉，与菌盖同色，伤后变藏绿色。菌柄圆柱形，中空，颜色较深于菌盖，该类型紫花菌与红汁乳菇（L. hatsudake）的形态一致（图1-B）。

2.2 紫花菌的分离培养特性

对贵州安顺、江口、开阳、花溪等具有代表性产地的农贸市场采集的紫花菌进行组织分离并成功获得20株菌株，部分分离菌株的菌丝培养特性见表3。从子实体的2个不同部位分离（菌盖、菌盖与菌柄交界处）取样均能萌发生成菌丝，菌丝萌发时间在5～6 d，菌盖相对菌盖与菌柄交界处晚1 d，菌丝形态特征分为两类，第一类：菌盖橙色，其菌丝为橙黄色，呈放射状平铺；第二类：菌盖黄褐色，其菌丝为白色至淡黄色，呈放射状平铺，有爬壁现象。

2.3 紫花菌与乳菇属ITS和GPD遗传距离 分析

测序结果表明，分离获得的20株菌株根据序列相似性可分为以下5组，ZHJ07-2、ZHJ08-1、ZHJ08-2、ZHJ08-3、ZHJ09-1、ZHJ07-1、ZHJ09-4、ZHJ09-5、ZHJ09-6、ZHJ09-7、ZHJ10-2、ZHJ10-1共12个菌株为第一组，ZHJ09-9、ZHJ08-4和ZHJ11-1共3个菌株为第二组，ZHJ09-3和ZHJ10-3为第三组，ZHJ11-2和ZHJ09-8为第四组，ZHJ09-2为第五组，各组内序列完全一致。

每组各选取1株菌株（ZHJ07-2、ZHJ08-4、ZHJ10-3、ZHJ09-2、ZHJ11-2）的多基因序列与GenBank中3种乳菇的多基因序列计算遗传距离。从表4中可以看出，ZHJ07-2、ZHJ08-4与鲜艳乳菇菌株的遗传距离为0，说明ZHJ07-2、ZHJ08-4与鲜艳乳菇菌株亲缘关系非常近，ZHJ07-2、ZHJ08-4与红汁乳菇、松乳菇菌株的遗传距离分别为0.022、0.025，说明这2株菌株与红汁乳菇、松乳菇菌株的亲缘关系较远。ZHJ09-2、ZHJ10-3、ZHJ11-2与红汁乳菇菌株的遗传距离为0，说明这3株菌株与红汁乳菇菌株的亲缘关系较近，ZHJ09-2、ZHJ10-3、ZHJ11-2与松乳菇、鲜艳乳菇菌株的遗传距离分别为0.015、0.022，说明这3株菌株与松乳菇、鲜艳乳菇菌株亲缘关系较远。综合上述分析，本次实验分离获得的20株菌株，其中15株菌株与鲜艳乳菇亲缘关系非常近；5株菌株与红汁乳菇亲缘较近。

2.4 紫花菌系统发育分析

在NCBI数据库上对扩增产物序列进行比对，发现收集到的紫花菌主要是松乳菇的近缘种，所以选取松乳菇等6个近缘种的基因序列作为参比序列，采用红乳菇作为外群。分离获得的20株菌株的ITS和GPD基因序列及13条参比菌株的ITS和GPD基因序列总长度为1 147 bp，其中一致的序列956 bp，无简约信息的可变碱基为100 bp，具有简约信息的碱基91 bp。以最简约法构建多基因系统树，共得到2棵最简约系统树，经Kishino- Hasegawa测试，系统树之间没有显著差异，树 长（TL）、一致性指数（CI）、保留指数（RI）和复定指数（RC）分别为：226、0.916、0.977和0.895。

对构建的多基因系统树进一步分析（图2），发现分离获得的20株菌株聚在2个分支。其中，ZHJ09-2、ZHJ09-3、ZHJ09-8、ZHJ10-3和ZHJ11-2共5个菌株以100%的自举支持率与红汁乳菇聚为一支，然后与松乳菇和橙色乳菇（L. akahatsu）聚为姐妹支，自举支持率为89%；分子系统学角度显示ZHJ09-2、ZHJ09-3、ZHJ09-8、ZHJ10-3和ZHJ11-2共5个菌株为红汁乳菇。另一类群的15个菌株全部与鲜艳乳菇聚为一支，自举支持率为100%，并与松乳菇、橙色乳菇、鲑色乳菇（L. salmonicolor）、红汁乳菇和血红乳菇（L. sanguifluus）这5个近缘种构成近缘种，揭示ZHJ07-1、ZHJ07-2、ZHJ08-1、ZHJ08-2、ZHJ08-3、ZHJ08-4、ZHJ09-1、ZHJ09-4、ZHJ09-5、ZHJ09-6、ZHJ09-7、ZHJ09-9、ZHJ10-1、ZHJ10-2和ZHJ11-1与鲜艳乳菇为同一种真菌。

3 讨论

传统的真菌分类主要依据形态特征。但是乳菇属多个种形态特征十分相似，仅通过形态学特征的传统方法很难将他们准确区分[18]，如红汁乳菇和血红乳菇，乳汁都是血红色，且子实体颜色和其他特征几乎没有区别。随着核酸分子生物学技术的发展，ITS及GPD序列作为一种分子标记已经广泛应用于系统发育研究和物种鉴定。桂明英等[19]基于ITS序列和形态学特征对新疆芦苇根蘑菇进行分类鉴定。张津京等[20]利用GPD基因序列分析斑玉蕈与其他真菌的亲缘关系。目前，运用分子生物学结合传统形态学鉴定真菌更准确可靠。

本研究依据形态学特征对鲜艳乳菇、松乳菇和红汁乳菇做了比较分析。鲜艳乳菇乳汁浅橙色，放置后不变色，子实体颜色鲜艳呈橙色，伤后变绿色，菌盖表面具有明显同心环纹，中部下凹，菌柄表面有蓝绿斑。红汁乳菇乳汁为血红色，放置后变酱油色，子实体黄褐色，伤后变深青色，菌盖表面同心环纹不明显，中部呈脐状，菌柄表面无窝斑。松乳菇乳汁橘红色，放置后不变色，子实体胡萝卜黄色，伤后变浅绿色，边缘伤后变绿显著，菌盖表面具明显同心环纹，中央脐状，菌柄表面具暗橙色窝斑[6]。综合上述分析，图1-A与鲜艳乳菇一致，图1-B与红汁乳菇一致。基于ITS和GPD基因序列的遗传距離和系统发育分析，显示分离获得的15株菌株与鲜艳乳菇的遗传距离为0，在系统发育树上以较高的自举支持率与鲜艳乳菇聚为一支；5株菌株与红汁乳菇的遗传距离为0，在系统发育树上与红汁乳菇聚为一支，自举支持率为100%。综合上述分析，分离获得的20株菌株中，15株为鲜艳乳菇，5株为红汁乳菇。

李静等[4]根据形态特征把贵州紫花菌定为紫铜色松乳菇，但是本研究基于形态学结合分子系统学对贵州紫花菌进行鉴定，发现贵州紫花菌主要为鲜艳乳菇，其次为红汁乳菇，并未鉴定出松乳菇。因此认为李静等[4]将贵州紫花菌定为紫铜色松乳菇应为误定。笔者在贵州市场上收集到的紫花菌中没有鉴定出松乳菇，可能与近年松乳菇采集过度或因环境改变导致其发生量减少有关。也有可能是松乳菇与鲜艳乳菇和红汁乳菇形态较为接近，不易区分导致错误鉴定有关。

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