真菌诱导子对龙眼胚性愈伤组织中类黄酮、类胡萝卜素和单宁含量的影响

刘生财 段俊朋 徐小萍 潘君飞 程春振 林玉玲 赖钟雄

摘 要 为探讨真菌诱导子与龙眼胚性愈伤组织中类黄酮、类胡萝卜素和单宁含量的相关性，以龙眼胚性愈伤组织细胞为材料，研究真菌诱导子种类、浓度及处理天数对龙眼愈伤组织细胞中类黄酮、类胡萝卜素和单宁含量的影响。结果表明：在固体培养基中加入100 mg/L拟茎点霉菌诱导子培养35 d时，最有利于类黄酮含量的积累，含量高达8.58 mg/g；拟茎点霉菌诱导子浓度为50 mg/L时培养35 d，最有利于类胡萝卜素含量的积累，其含量为36.83 μg/g；胶孢镰刀菌诱导子浓度为50 mg/L时的培养基中培养35 d，最有利于单宁含量的积累，其含量为10.50 mg/g。液体悬浮培养条件下，胶孢镰刀菌诱导子浓度为400 mg/L的培养基中培养7 d，最有利于类黄酮含量的积累，其含量为6.29 mg/g；尖孢镰刀菌诱导子浓度为200 mg/L的培养基中培养7 d，最有利于类胡萝卜素含量的积累，其含量为49.21 μg/g；胶孢镰刀菌诱导子浓度为400 mg/L的培养基中培养7 d，最有利于单宁含量的积累，其含量为13.15 mg/g。本研究为将来龙眼胚性愈伤组织细胞工厂化生产类黄酮、类胡萝卜素和单宁等次生代谢物质奠定理论基础并提供技术指导。

关键词 龙眼；胚性愈伤组织；真菌诱导子；类黄酮；类胡萝卜素；单宁

中图分类号 S667.2 文献标识码 A

Abstract To study the correlation between fungi elicitors and flavonoids， carotenoids and tannins in the embryogenic calli of longan， the embryogenic calli were used as the materials to investigate the effects of different kinds of fungi elicitors for the contents of flavonoids， carotenoids and tannin in callus cells. The results showed that under the condition of solid culture， the flavonoid content was the highest （8.58 mg/g） under the treatment of 100 mg/L Phomopsis longanae Chi for 35 d， and the carotenoid content was the highest （36.83 μg/g） under 50 mg/L P. longanae Chi treatment. For tannin， however， the content was the highest （10.50 mg/g） under Fusarium subglutinans Wollenw. et Reinkin treatment for 35d. Under liquid culture， the flavonoid content was the highest （6.29 mg/g） under the treatment of 400 mg/L F. subglutinans Wollenw. et Reinkin treatment for 7 d， the carotenoid content was the highest （49.21 μg/g） under the treatment of 200 mg/L F. Oxysporum for 7 d， and the tannin content was the highest （13.15 mg/g） under 400 mg/L F. subglutinans Wollenw. et Reinkin treatment for 7 d. The above results could provide a scientific basis and technical support for studying the metabolic mechanism of flavonoids， carotenoids and alkaloids.

Keywords Dimocarpus longan Lour； embryogenic calli； fungal elicitors； flavonoids； carotenoids； tannins

DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.09.015

龍眼（Dimocarpus longan Lour.）属于无患子科龙眼属，是我国著名的热带亚热带特色水果之一，富含多种次生代谢产物，素有“南方人参”美誉，是国家卫生部公布的法定的药用和食用两用的植物。龙眼中含有类黄酮、类胡萝卜素、单宁等多种次生物质[1-2]，具有很高的营养价值和药用功能[3-4]。类黄酮是一大类重要的次生代谢产物，具有多种生物功能，包括药用价值和保健功能，类黄酮生物合成研究已经成为植物次生代谢基因工程、代谢工程的主要目标[5]；类胡萝卜素是目前国际上开发和应用最广泛的天然色素之一，可作为食品、化妆品的着色剂被广泛应用，而且具有丰富的营养价值[6]，预防和减缓癌症的发展[7]；单宁也是具有抗氧化、抗癌等药用价值和保健功能[8]，具有广阔的市场前景。

根据植物细胞全能性理论，利用愈伤组织细胞可生产植物次生代谢产物。通过组培的方式能够大大缩短生产周期，人为调控环境，不受季节等因素影响，实现周年生产，而且不会破坏生态资源。植物体中次生代谢产物的积累受到多种因素影响，诱导或者提高植物体内次生代谢产物产量具有重要的应用前景。研究人员通过物理手段（如pH、温度等）和化学因素（如激素、诱导子等）提高生物体内代谢产物产量。尤其近几年发现真菌诱导子能引起植物细胞生长及影响细胞产生代谢物质含量的积累[9]。真菌诱导子能使植物产生过敏反应，并通过诱导植物积累特定的次生代谢产物来提高防御抗病能力[10]。在青钱柳（Cyclocarya paliurus）[11]、雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook. f.）[12]、南方红豆杉（Taxus chinesis var. mairei）[13]、北柴胡（Bupleurum chinense DC.）[14]等悬浮细胞培养中添加真菌诱导子可大幅度提高细胞中的有效成分含量。在龙眼果肉中可分离获得龙眼拟茎点霉、镰刀菌和炭疽菌。添加一定的龙眼拟茎点霉、尖孢镰刀菌和胶孢镰刀菌，可影响龙眼胚性愈伤组织中影响多糖[15]和类黄酮含量[16]，但贺梦真等[16]只是进行了低浓度真菌诱导子诱导龙眼胚性愈伤组织细胞中类黄酮含量影响，较高浓度的真菌诱导子对龙眼胚性愈伤组织细胞中类黄酮含量影响效果还明确。因此，为探讨真菌诱导子与龙眼胚性愈伤组织中类黄酮、类胡萝卜素和单宁含量的相关性，本研究以龙眼胚性愈伤组织为材料，研究真菌诱导子对龙眼胚性愈伤组织细胞中类黄酮、类胡萝卜素和单宁含量的影响，为将来龙眼胚性愈伤组织细胞工厂化生产类黄酮、类胡萝卜素和单宁等次生代谢物质奠定理论基础并提供技术指导。

1 材料与方法

1.1 材料

实验材料为长期保存的龙眼胚性愈伤组织，来自福建农林大学园艺植物生物工程研究所[17]。

1.2 方法

1.2.1 真菌诱导子的制备 参照Wang等[18]的方法，制备胶孢镰刀菌、尖孢镰刀菌和拟茎点霉菌（菌种由福建农林大学植物保护学院赠送）真菌诱导子。采用苯酚硫酸法[19]测定菌液中总糖含量的浓度（mg/L），根据真菌诱导子中的含糖量确定真菌诱导子的添加量。

1.2.2 真菌诱导子种类和浓度的筛选 将0.04 g龙眼胚性愈伤组织接种于固体培养基中，以MS+1.0 mg/L 2，4-D+20 g/L蔗糖+100 mg/L肌醇+7 g/L琼脂为基本培养基，pH为5.8，分别加入（胶孢镰刀菌、尖孢镰刀菌和拟茎点霉菌）3种真菌诱导子，每种真菌诱导子分别设置浓度分别为50、100、200、300、400、500 mg/L，以不添加任何真菌诱导子为对照（Mock），然后放置于（25±2） ℃培养室进行20 d暗培养。收取龙眼胚性愈伤组织，置于60 ℃下烘干，研磨成粉末備用。每种处理3次重复。

将2.0 g龙眼胚性愈伤组织接种于液体培养基中，以MS+1.0 mg/L 2，4-D+20 g/L蔗糖+100 mg/L肌醇为基本培养基，pH 5.8，分别加入（胶孢镰刀菌、尖孢镰刀菌和拟茎点霉菌）3种真菌诱导子，每种真菌诱导子浓度分别设置为50、100、200、300、400、500 mg/L，以不添加任何真菌诱导子为对照（Mock），然后放置于（25±2） ℃，转速为110 r/min的摇床上，黑暗培养7 d时收取龙眼悬浮细胞，置于60 ℃下烘干，研磨成粉末备用。每种处理3次重复。

1.2.3 真菌诱导子处理时间的筛选 将0.04 g龙眼胚性愈伤组织接种于固体培养基中，以MS+ 1.0 mg/L 2，4-D+20 g/L蔗糖+100 mg/L肌醇+7 g/L为基本培养基，pH为5.8，添加本研究筛选得到最佳真菌诱导子种类和浓度，以不添加任何真菌诱导子为对照（Mock），放置于（25±2） ℃培养室进行10、15、20、25、30、35 d暗培养，然后收取龙眼胚性愈伤组织，将样品置于60 ℃下烘干，研磨成粉末备用。每种处理3次重复。

将2.0 g龙眼胚性愈伤组织接种于液体培养基中，以MS+1.0 mg/L 2，4-D+20 g/L蔗糖+ 100 mg/L肌醇+7 g/L为基本培养基，pH为5.8，添加筛选得到最佳真菌诱导子种类和浓度，以不添加任何真菌诱导子为对照（Mock），放置于（25±2） ℃，转速为110 r/min的摇床上，黑暗培养1、3、5、7、9、11 d时收取龙眼悬浮细胞，置于60 ℃下烘干，研磨成粉末备用。每种处理3次重复。

1.2.4 龙眼胚性愈伤组织中类黄酮、类胡萝卜素及单宁含量测定 参考董慧雪等[20]的方法提取和测定龙眼胚性愈伤组织中类黄酮；参考张志军等[21]的方法提取及测定样品的类胡萝卜素；参考鞠春艳等[22]的方法提取及测定样品的单宁。

1.3 数据处理与分析

使用SPSS 19.0数据处理软件进行相关分析、方差分析和显著性测验，利用Excel 2010对所获得的数据进行图表制作。

2 结果与分析

2.1 真菌诱导子种类和浓度对龙眼胚性愈伤组织中类黄酮含量的影响

真菌诱导子种类和浓度对龙眼胚性愈伤组织类黄酮含量有明显影响。由表1可见，固体培养基中添加拟茎点霉菌可有效地提高龙眼胚性愈伤组织中类黄酮含量，而且随着浓度升高呈先上升后下降趋势。当添加拟茎点霉菌浓度为100 mg/L时，龙眼胚性愈伤组织中类黄酮含量达到了5.39 mg/g，是对照组的4.11倍，且差异极显著（p<0.01）。而添加尖孢镰刀菌和胶孢镰刀菌时，对龙眼胚性愈伤组织类黄酮含量增加效果远不如添加拟茎点霉菌。因此，添加100 mg/L拟茎点霉菌对龙眼胚性愈伤组织中类黄酮累积效果最好。

由表1可知，在液体悬浮培养过程中，添加真菌诱导子对龙眼胚性愈伤组织中类黄酮含量影响与固体培养条件下差异非常大。添加拟茎点霉菌对龙眼胚性愈伤组织中类黄酮累积有抑制作用，而且抑制效果达到极显著水平；而添加一定浓度胶孢镰刀菌可以促进类黄酮累积。随着胶孢镰刀菌浓度增加，类黄酮含量呈“下降—上升—下降”趋势，且在浓度为400 mg/L时，龙眼悬浮细胞中类黄酮含量最高，是对照组的1.28倍，达到了极显著水平。

2.2 拟茎点霉菌处理时间对固体培养龙眼胚性愈伤组织中类黄酮含量的影响

根据真菌诱导子种类和浓度筛选结果，在固体培养基中加入100 mg/L拟茎点霉菌，分析不同处理时间对龙眼胚性愈伤组织类黄酮含量的影响。由表2可见，随着处理时间延长，龙眼胚性愈伤组织中类黄酮含量呈上升趋势。在培养35 d时，培养基中添加拟茎点霉菌和对照培养基的龙眼胚性愈伤组织中类黄酮含量都达到最高，与其他处理时间相比达到极显著水平，但拟茎点霉菌处理下类黄酮含量是8.58 mg/g，为对照的1.56倍。由此可知，添加100 mg/L拟茎点霉菌培养35 d有利于类黄酮含量的积累。

2.3 胶孢镰刀菌处理时间对龙眼悬浮细胞中类黄酮含量的影响

根据真菌诱导子种类和浓度筛选结果，在液体培养基中加入400 mg/L胶孢镰刀菌，比较不同处理时间对龙眼悬浮细胞中类黄酮含量影响。由表3可见，龙眼悬浮细胞类黄酮含量随着培养时间的延长而增加，在悬浮培养7 d时含量最高，为5.75 mg/g，极显著高于其他处理时间，随后类黄酮的含量逐渐减少。由此可得添加400 mg/L胶孢镰刀菌悬浮培养7 d最有利于类黄酮含量的积累。

2.4 真菌诱导子种类和浓度对龙眼胚性愈伤组织中类胡萝卜素含量的影响

真菌诱导子种类和浓度对龙眼胚性愈伤组织类胡萝卜素含量有明显影响。由表4可见，在固体培养基上添加真菌诱导子对龙眼胚性愈伤组织类胡萝卜素含量积累几乎都有抑制，而且随着浓度增加抑制效果越明显。只有添加50 mg/L拟茎点霉菌真菌诱导子对龙眼胚性愈伤组织中类胡萝卜素含量有促进作用，含量高达21.50 μg/g，是对照组的1.41倍。

液体悬浮培养条件下，真菌诱导子对类胡萝卜素含量累积也是有抑制作用，但效果没有固体培养条件下明显。表4也可以看出，添加尖孢镰刀菌浓度为200 mg/L对龙眼悬浮细胞中类胡萝卜素含量有促进作用，与其他组相比达到极显著水平，是对照组的1.16倍。且与固体培养相比，液体培养对促进龙眼悬浮细胞中类胡萝卜素含量累积的作用效果更明显。

2.5 拟茎点霉菌处理天数对固体培养龙眼胚性愈伤组织中类胡萝卜素含量的影响

在固体培养基中加入50 mg/L拟茎点霉菌，分析不同处理天数对龙眼胚性愈伤组织类胡萝卜素含量的影响。由表5可见，处理天数越久，龙眼胚性愈伤组织类胡萝卜素含量越高。在培养30 d前，对照中类胡萝卜素含量高于添加50 mg/L拟茎点霉菌的。但是，对照在培养20 d后，龙眼胚性愈伤组织中类胡萝卜素含量增加比较缓慢，而添加50 mg/L拟茎点霉菌却能够保持快速增加，一直到培养结束，说明拟茎点霉菌可能是在胚性愈伤组织培养的中后期对类胡萝卜素含量累积有作用。

2.6 尖孢镰刀菌处理天数对龙眼悬浮细胞中类胡萝卜素含量的影响

在液体培养基中加入200 mg/L尖孢镰刀菌，分析不同处理天数对龙眼悬浮细胞类胡萝卜素含量的影响。由表6可见，龙眼悬浮细胞类胡萝卜素含量随着培养天数的增加而增加，在悬浮培养7 d后，类胡萝卜素的含量逐渐减少。由此可得添加200 mg/L尖孢镰刀菌悬浮培养7 d最有利于类胡萝卜素含量的积累。

2.7 真菌诱导子种类和浓度对龙眼胚性愈伤组织中单宁含量的影响

真菌诱导子种类和浓度对固体培养龙眼胚性愈伤组织单宁含量有明显影响。由表7可见，与对照相比，添加拟茎点霉菌和胶孢镰刀菌均表现为随着浓度的增加，龙眼胚性愈伤组织单宁含量先增高后降低的趋势，而添加尖孢镰刀菌随着浓度的增加，龙眼胚性愈伤组织单宁含量逐渐降低。当添加胶孢镰刀菌浓度为50 mg/L时，龙眼胚性愈伤组织中单宁含量最高，达到了6.42 mg/g，是对照组的1.46倍；浓度为500 mg/L时，龙眼胚性愈伤组织中单宁含量明显低于其他处理和对照。而在液体培养基中添加胶孢镰刀菌浓度为400 mg/L对龙眼悬浮细胞中单宁含量有促进作用，是对照组的1.32倍。

2.8 胶孢镰刀菌处理天数对龙眼胚性愈伤组织单宁含量的影响

胶孢镰刀菌对龙眼胚性愈伤组织中单宁含量有促进作用。由表8可见，在固体培养基中加入50 mg/L胶孢镰刀菌后，随着培养时间的延长，龙眼胚性愈伤组织中单宁含量越高，而且高于对照，在培养35 d时单宁含量累积最多。

从表9可知，在液体培养基中加入400 mg/L胶孢镰刀菌，龙眼悬浮细胞中单宁含量随着培养天数增加，先增高后降低，第7天的含量达到最高，为13.15 mg/g；而对照在第9天时含量才达到最高，为11.32 mg/g，说明添加400 mg/L胶孢镰刀菌悬浮培养可以促进单宁在较短时间内就可以积累。同时与固体培养条件相比，液体悬浮培养更有利于单宁累积。

3 讨论

3.1 适宜的真菌诱导子类型和浓度有利于龙眼胚性愈伤组織中次生代谢产物积累

真菌诱导子（fungal elicitor）主要是通过分离真菌菌丝体或发酵液制备而成的含有真菌及代谢物的灭菌溶液，能引起植物细胞生长及影响细胞产生代谢物质含量的积累[9]。不同的真菌诱导子及浓度对不同植物材料的作用效果也存在很大差别。200 mg/L黑曲霉诱导子处理青钱柳悬浮细胞3 d三萜含量为对照的10.79倍[11]；50 mg/L苹果炭疽和柿子炭疽诱导子的加入不仅使不定根中雷公藤甲素的含量分别提高了2.24、1.93倍，生物碱的含量也分别提高了2.02、2.07倍[12]；60 mg/L尖孢镰刀菌促进南方红豆杉紫杉醇的合成，与对照相比提高了5倍左右[13]；1 ml/L黑曲霉诱导子处理北柴胡毛状根后的柴胡皂苷为对照的1.31倍[14]；80 mg/L炭角菌处理毛葡萄后黄酮和总酚分别为对照的1.76、1.65倍[23]。虽然在青钱柳、雷公藤、南方红豆杉、柴胡、毛葡萄等悬浮细胞培养中添加真菌诱导子可大幅度提高细胞中的有效成分含量，怀地黄组培苗中添加真菌诱导子可提高其次生代谢产物含量[24]，但不同植物使用的诱导子及浓度也不一致，可能是因为不同的真菌诱导子参与了不同类型次生代谢产物代谢通路。对长春花研究发现，致病性真菌可以强烈促进长春花合成生物碱，而非致病性真菌效果不明显[25]。本文研究了胶孢镰刀菌、尖孢镰刀菌和拟茎点霉菌不同浓度添加量对龙眼胚性愈伤组织中类黄酮、类胡萝卜素及单宁含量积累的影响，发现400 mg/L的胶胞镰刀菌处理龙眼胚性愈伤组织后类黄酮和单宁的含量分别为对照的1.28、1.32倍，50 mg/L的拟茎点霉菌处理后类胡萝卜素的含量为对照的1.41倍。该研究结果与贺梦真[16]研究发现100 mg/L的拟茎点霉菌处理龙眼胚性愈伤组织后类黄酮含量最高不一致，可能是因为处理浓度范围和时间差异，本研究处理的浓度范围更大，更有利于筛选出最佳处理浓度范围。 因此，只有选择适宜的真菌诱导子类型和浓度才有利于龙眼胚性愈伤组织细胞中次生代谢产物含量累积。

3.2 真菌诱导子处理时间对龙眼胚性愈伤组织中次生代谢产物积累的影响较大

除了真菌诱导子的种类和浓度之外，诱导处理的时间和培养方式也会对次生代谢产物产生很大的影响。真菌诱导子处理白桦悬浮细胞1 d三萜含量就能达到最高[26]，黑曲霉诱导子处理青钱柳悬浮细胞3 d三萜含量和产量均达到最高[11]，在积雪草添加哈茨木霉菌的第10天积雪草苷含量比对照组增加了2.35倍[27]。不同日龄的长春花悬浮细胞对诱导子的敏感性和反应不同，培养20 d的长春花悬浮细胞在绿色木霉诱导子作用下能显著刺激阿玛碱的产生[28]。本研究也发现，不同真菌诱导子的处理时间对固体和液体培养的龙眼胚性愈伤次生代谢积累的差别较大，且液体悬浮培养比固体培养更能在短时间内获得大量的次生代谢产物，而且产量也高于固体培养。可能是因为在固体培养条件下，龙眼胚性愈伤组织细胞没有完全接触到培养基，诱导子对其作用存在缓释和间接作用，从而促使龙眼中次生代谢产物的累积需要更长时间；而在悬浮培养中，因为细胞完全接触培养基，诱导子可以快速直接作用于细胞，从而影响了次生代谢产物累积，并且不同的培养方式所需要的真菌诱导子类型或者浓度也有所差别。真菌诱导子是如何参与植物次生代谢通路还需要进一步研究。

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