棉花SSR标记在红麻中的通用性

方书生 谢雄峰 祁建民 张列梅 徐建堂 林荔辉 张立武

摘 要 红麻与棉花属于锦葵科不同属的天然纤维作物，利用棉花SSR引物的通用性可以丰富红麻SSR标记。本研究从陆地棉每条染色体上随机均匀挑选10对SSR引物，共260对，对24份不同来源的红麻种质进行多态性分析。结果显示，139对（53.5%）引物扩增出了清晰的条带，128对（49.2%）引物表现出多态性，共扩增出292条带，平均每对引物扩增出2.1条带，平均多态信息量为0.5419。表明这些引物在红麻中的通用性和多态性好。位于陆地棉染色体A1、A5和D8上的SSR引物在红麻中扩增多态性较高。聚类分析表明，24份红麻种质可分为2个类群，进一步划分为4个亚群，与地理来源和系谱关系较一致。这些结果既证实了棉花SSR引物应用于红麻是可行的，又有助于红麻与棉花比较基因组学和遗传育种研究。

关键词 红麻；SSR引物；遗传多样性；通用性

中图分类号 S31 文献标识码 A

Abstract Kenaf and cotton are natural fiber crops of the Malvaceae family in different genera， universality of SSR primers from cotton could enrich the SSR markers of kenaf. In this study， ten pairs of SSR primers were randomly and evenly selected from each chromosome of upland cotton. Totally， 260 pairs were used to test the polymorphism of 24 different varieties of kenaf. The results showed that 139 （53.5%） pairs of primers amplified clear bands， 128 （49.2%） pairs presented polymorphism. In total， 292 bands were amplified， and an average of 2.1 bands was amplified for each primer. The average of polymorphic information content was 0.5419. All these indicated that these primers from upland cotton had good universatility and polymorphism in kenaf. The SSRs locating on chromosomes A1， A5， and D8 on upload cotton showed high polymorphism in kenaf. Cluster analysis indicated that the 24 kenaf varieties could be divided into two groups， which were further divided into four subgroups， in according with geographical sources and pedigrees. These results confirmed that cotton SSR primers could be suitable for kenaf and be useful in comparative genomics and genetic breeding between kenaf and cotton.

Keywords kenaf； SSR primer； genetic diversity； universality

DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.07.017

紅麻（Hibiscus cannabinus，2n=36），又称作大槿麻、洋麻、钟麻等，是世界上非常重要的一年生韧皮纤维作物，属于锦葵科（Malvaceae）木槿属二倍体植物[1]。红麻韧皮纤维具有抑菌性强、透气性高、吸湿性好、易染色、抗静电、水分散失快、拉力强、降解性强等优良特性，在工业上，其纤维可用于生产汽车的内衬、轻型板材、手提袋、麻纺织、绒毛浆，而其茎干则用于生产麻炭及环境友好型的吸附材料，同时还可以转化成乙醇、麻塑料，用于生产麻油，麻酵素等，是一种十分重要的工业原料作物。因此红麻被称为21世纪很有潜力的优势作物[2-3]。

微卫星，又称简单序列重复（simple sequence repeats，SSRs），是当前运用较广、比较理想的一种分子标记技术[4]，已经成功地应用于品种的鉴定、物种的分类比较及遗传图谱构建等研究[5]。但是，由于红麻基因组尚未破译，目前应用到红麻中的SSR标记比较有限，这直接影响了红麻的遗传育种研究。因此，开发出新的SSR引物显得十分重要。当前，获得SSR引物的途径主要有3种：一是在基因组文库中进行筛选，如Mir等[6]开发黄麻SSR引物；二是在GenBank等数据库和相关文献中查询，如黄麻EST-SSR引物开发[7]；三是从近缘物种中获得已设计好的引物，如Satya等[8]探索棉花和黄麻的SSR引物在锦葵科22个不同属的多态性。尽管课题组前期利用转录组测序数据，开发了11 083对HcEMS编号的SSR引物[9]和94对HcES编号的SSR引物[10]，但未探索红麻与近缘物种的SSR通用性。物种间的SSR侧翼序列相对保守，从某一物种中筛选出SSR引物用于其近缘种属的扩增，是一种效率高、成本低、实用性强的获取标记的途径[8]。

红麻与棉花同属于锦葵科，两者之间具有较好的共线性[9]。与棉花相比，红麻的遗传研究进展相对落后。利用棉花遗传信息加强红麻的遗传育种研究，对于发现新基因、创造新种质、培育高产优质适应性强的红麻品种具有重要意义。陆地棉已经开发出了大量的SSR引物[11]，其通用性也在非同源物种香蕉中得到了验证[12]。武耀龙等[13]利用64对棉花引物在红麻中初步进行了通用性的研究，但该实验使用的棉花SSR引物和红麻实验材料偏少。本研究拟通过260对陆地棉SSR引物在24份红麻基因组中的扩增情况来检测棉花引物在红麻中是否通用，评价多态性比例，一方面为红麻提供更多的SSR标记，另一方面有助于红麻与棉花的比较基因组学研究。

1 材料与方法

1.1 材料

以24份不同原产地的红麻种质资源为实验材料，如表1所示，均由福建农林大学麻类遗传育种与綜合利用实验室提供。2016年5月1日种植于福建省三明市尤溪县福建农林大学洋中科教基地。

1.2 方法

1.2.1 红麻基因组DNA的提取 使用改良的CTAB法提取红麻基因组DNA[14]，提取后的DNA进行浓度测定。当DNA浓度符合要求（OD260/ OD280在1.8～2.0）时，将提取的DNA用TE溶液稀释到50 ng/μL，于–20 ℃保存，用于PCR的扩增。

1.2.2 SSR引物挑选 本研究从陆地棉每条染色体上随机挑选10对SSR引物[11]，如附表1所示，共260对SSR引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.2.3 PCR扩增与PAGE电泳检测 PCR体系为：2.0 μL DNA溶液（50 ng/L），0.5 μL 引物（forward+reverse），3.75 μL 2×Taq Master Mix（厦门泰京生物技术有限公司），3.75 μL ddH2O，组成10 μL的PCR体系，加10 μL液体石蜡油覆盖，离心后混匀用于PCR。

PCR的程序为：95 ℃预变性3min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s（每个循环退火温度降低0.5 ℃），72 ℃延伸45 s，一共10个循环；95 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，共35个循环；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。

利用9%非变性聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）电泳检测，其实验方法参考万雪贝等 [10]的方法。

1.3 数据的记录与分析

根据分子量标准标记的片段大小估算扩增片段的大小。采用0和1的读带方法，有带的记为“1”，无条带的记为“0”。再利用NTSYSpc2.1e软件对24份红麻材料进行聚类分析，生成聚类图。

2 结果与分析

2.1 棉花SSR引物在红麻中的扩增结果统计

陆地棉共26条染色体，分成A基因组染色体（A1～ A13）和D基因组染色体（D1～ D13） 。每条染色体上选取10对引物，共260对棉花SSR引物。260对棉花SSR引物在24份红麻种质资源进行扩增（附表1和图1）。139对引物扩增出了条带（比例为53.5%），表明通用性较好，总共获得292条带。片段大小变化在70～720 bp，每对引物扩增出来的条带数变化在1～7条，平均每对引物扩增出2.1条带。计算其PIC（多态信息量），最小值为0.079 9（RES_008），最大值为0.900 6（RES_247），平均多态信息量为0.541 9，说明了大部分棉花SSR引物在红麻中具有较高的多态性，证实了棉花SSR引物应用于红麻是可行的。

在比较SSR引物通用性的基础上，进一步分析了其多态性。在139对棉花SSR引物扩增带型中，128对在红麻中表现出多态性，占所有引物的多态性比例为49.2%。从数据可以看出，棉花SSR引物在红麻中多态性比率是较高的。可能的原因是棉花和红麻属于同科不同属，具有一定的亲缘关系，能够形成良好的多态性。当然，不同引物扩增出来的多态性条带数差异较大。其中，产生多态性条带较多的引物是RES_45和RES_ 46、RES_244、RES_247，分别产生了7条和6条、6条、6条多态性条带。

2.2 棉花不同染色体上的SSR引物在红麻中的多态性分析

陆地棉各染色体的扩增及多态性情况如图2所示。其中A基因组的13条染色体中共有71对SSR引物可以在红麻中扩增出条带，68对SSR引物表现出多态性，比率分别为54.6%和52.3%；D基因组的13条染色体中共有68对SSR引物可以在红麻中扩增出条带，60对SSR引物表现出多态性，比率分别为52.3%和46.2%。说明陆地棉A

基因组中的13条染色体上挑选出来的引物的扩增率及多态性略高于D基因组染色体。

在A基因组染色体中，染色体A1、A5上各有9对SSR引物在红麻中扩增出来，表现出多态性的有9对，扩增率和多态率都达到90%；染色体A8上只有1对SSR引物被扩增出来，并表现出多态性，扩增率和多态率为10%。在D基因组染色体中，染色体D8上有10对SSR引物在红麻中扩增出来，表现出多态性的有10对，扩增率和多态率都达到100%；染色体D11上只有2对SSR引物被扩增出来，表现出多态性的只有1对，扩增率和多态率分别为20%和10%。从数据可以看出，棉花不同染色体上的SSR引物的扩增率和多态率是不同的，A1、A5和D8染色体上SSR引物在红麻的扩增率和多态率最高，而A8和D11最低。这些分析可以为红麻更有针对性地挑选多态性高的棉花染色体上的SSR引物。

2.3 基于棉花SSR标记的红麻种质遗传多样性分析

应用NTSYS软件对24份红麻种质进行聚类分析（图3），遗传相似系数最大的为0.87（80FH5和T19），而最小的为0.35。以遗传相似系数0.58为阈值，可以把24份红麻种质分成两个类群，其中类群1（Pop1）有且只有AfricaLY，类群2（Pop2）包括其他23份红麻种质。这说明AfricaLY这一种质同其他红麻种质的亲缘关系较远，可以将AfricaLY同其他23份红麻种质区分开来。进一步以遗传相似系数0.64为阈值，可以把24份红麻种质分成4个亚群（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ），其中类群Pop1只有一个亚群（Ⅰ），有且只有AfricaLY；而Pop2有3个亚群（Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ）。其中，亚群Ⅱ有42KD3、K57SCS11061、K56taihongZ等18个种质，亚群Ⅲ有FH2、KG121和Zambia1共3个种质，亚群Ⅳ有ZHM16、7380共2个种质。24份红麻种质中，18份红麻种质在亚群Ⅱ中，表明亚群Ⅱ中的这些种质的亲缘关系比较近，遗传差异较小。

3 讨论

利用260对棉花SSR引物在红麻中进行扩增，其中有139对引物扩增出了条带，比例为53.5%，但仍然有121对来自棉花基因组中的SSR引物还没有被扩增出来，可能是因为这些SSR的基因位点属于棉花所特有的。课题组前期利用红麻转录组数据与棉花进行共线性分析，发现8.99%基因是雷蒙德氏棉花所特有的[9]。

简单重复序列SSR具有操作简便、高共显性、高多态性等特点，但由于其扩增位点较少，开发成本高，所以研究物种之间SSR分子标记的通用性有利于提高引物的利用效率，降低引物的开发成本[15]。近几年来，红麻SSR分子标记的开发比较少，研究者只能利用随机扩增多态性DNA标记， 如陶爱芬等[16]通过福红2号等4份品种DNA为模板，筛选出了17对多态性较好的ISSR引物。很多研究表明，SSR引物在近缘物种以及一些远缘物种中都具有良好的通用性。卢玉飞等[17]通过用382对玉米SSR引物和100对甘蔗EST-SSR引物在84份芒属材料中进行通用性的实验，其中多态性比例分别为10.21%和13.00%。唐鑫等[18]研究发现，1824对西瓜基因组SSR引物在有棱丝瓜、苦瓜、冬瓜中的多态性比例分别为3.84%、1.81%和0.44%。付飞等[19]利用204对玉米SSR引物在高粱中进行通用性分析，通用性比例和多态性比例分别为75%、27.9%。红麻和棉花同属于锦葵科不同属的作物，本研究选取了260对棉花SSR引物对24份红麻种质进行PCR扩增，其中139对引物扩增出了条带，通用性比例达53.5%，128对引物具有多态性条带，多态性比例达49.2%。本研究的通用性比例及多态性比例虽较武耀龙等[13]的89%和56%要低，但武耀龙等[13]的实验仅有64对棉花引物，实验所用到的引物基数偏少。本研究利用260对棉花SSR引物、24份红麻材料，得到了更多的实验数据，发现棉花不同染色体上的SSR引物的扩增率和多态率是不同的， 暗示着棉花和红麻物种分化后，染色体存在重排现象。这些表明，棉花引物应用到红麻分子标记研究中是可行的，也初步证实了近缘物种间SSR引物是可以通用的。

本研究通过NTSYS软件进行聚类分析，以遗传相似系数0.58为阈值，把24份红麻种质分成2个类群，其中AfricaLY单独一个类群（Pop1），其他的23个红麻种质一个类群（Pop2）。从类群的划分可以看出，非洲裂叶同其他23份红麻种质之间存在着较大的遗传差异，而这种差异是因为非洲裂叶来源于非洲，其地理来源同其他种质都有较大的差异。而在亚群划分上，AfricaLY单独划分为亚群Ⅰ；亚群Ⅱ共包含18份种质，其中有17份种质产地都处于北纬0°～30°，亲缘关系最近的是T19和福红5号。德国的SCS-11-06-1虽然也被划分在亚群Ⅱ内，但聚类图中显示其与KD3-2、Taihong-2和722-3亲缘关系稍近，跟亚群Ⅱ其他种质亲缘关系仍然较远。亚群Ⅲ包含来自赞比亚的Zanyin No. 1，而福红952划分在亚群Ⅱ內，这说明Zanyin No. 1和福红952能被被区分开来。从其地理来源来看， Zanyin No. 1是在低纬度国家赞比亚选育而成的，而福红952是在亚热带地区福建省选育而成的，所以两者之间存在较大的差异。课题组前期[20]进行的红麻光周期反应敏感度的实验表明，福红952光周期反应敏感度为56.2%，Zanyin No.1光周期反应敏感度为36.0%，进一步证实了这2份种质之间存在着较大差异。

本研究通过棉花SSR分析24份红麻种质的遗传多样性，遗传相似系数变化为0.35～0.87，与前人研究相比，如陶爱芬等[16]通过ISSR对30份红麻种质进行分析得到的遗传相似系数0.70～0.95，以及郑海燕等[21]通过SRAP对51份红麻种质进行分析得到的遗传相似系数0.62～0.99，这24份红麻种质资源之间的遗传距离较大，亲缘关系较远。这些体现出，棉花SSR引物对红麻进行遗传多样性分析是可行的，这不仅丰富了红麻的SSR分子标记，而且为红麻和棉属的比较基因组学和遗传研究提供了依据。

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