高效液相色谱法测定香蕉中3种胺类物质

罗云 赵方方 马晨 吕岱竹 王明月

摘 要 建立了高效液相色谱法测定香蕉中5-羟色胺、色氨酸和褪黑素的分析方法：香蕉样品经甲醇漩涡提取，采用多壁碳纳米材料（MWCNTs）分散固相萃取净化。5-羟色胺、色氨酸和褪黑素的分离采用C18色谱柱，以0.05 mol/L乙酸钠水溶液-甲醇为流动相。目标物质的线性范围为0.25～5mg/L，标准曲线相关系数均在0.99以上；平均加标回收率（n=6）为74.0%～110%，RSD≤3.99%。该方法简单快捷，重复性好，可用于香蕉中5-羟色胺、色氨酸和褪黑素的测定。

关键词 香蕉；5-羟色胺；色氨酸；褪黑素；高效液相色谱法

中图分类号 S668.1 文献标识码 A

Abstract The objective of the study was to establish a method for the determination of serotonin， tryptophan and melatonin in bananas by high performance liquid chromatography （HPLC）. The methods of extraction， purification and detection for the three amines were optimized. The analytes in bananas were extracted by whirlpool mixer with methanol， purified with multi-walled carbon nanomaterials （MWCNTs）， separated on a C18 column. The mobile phase was consisted of methanol and 0.05 mol/L sodium acetate. The linear range of the target material was 0.25-5 mg/L. The calibration curves of the analytes showed a good linear relationship， and the correlation coefficient was above 0.99. The average recoveries were in the range of 74.0%–110% with relative standard deviation （RSD） less than 3.99% （n=6）. The method is simple， rapid and with good reproducibility and can be used in the determination of serotonin， tryptophan and melatonin in bananas.

Key words banana； serotonin； tryptophan； melatonin； high performance liquid chromatography

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.04.027

香蕉作为世界四大水果之一，因其口感独特、香甜美味，深受广大消费者的喜爱。香蕉不仅富含糖、蛋白质、维生素、微量元素等营养成分，还含有类胡萝卜素、多酚、多糖等活性成分，具有抗氧化、抗溃疡、降血糖、治腹泻、抗肿瘤、抗抑郁等保健功效[1]。香蕉具有眾多功能成分而被广泛关注。关于香蕉多糖、多酚的研究已有不少，而有关香蕉中功能性成分胺类物质的文献报道较少，其中色氨酸（tryptophan，Trp）是人体必需氨基酸，体内无法合成，必须从食物中摄取。色氨酸是合成5-羟色胺（serotonin，5-HT）和褪黑素（melatonin，MT）的前体。5-羟色胺有抗氧化活性，能清除游离的自由基，具有调节人体内免疫反应、抑制脂肪形成、抑制肿瘤、强烈抑制黑色素生成、保护人体中的自然杀伤细胞免受程序性死亡等功能[2-6]。褪黑素具有抗氧化作用，能清除生物体内的自由基，延缓衰老，同时具有免疫调节、改善睡眠、抗癌、抗心血管疾病等作用[7-10]。因此研究香蕉中的5-羟色胺、色氨酸、褪黑素对扩展香蕉功能性营养以及提高产业发展水平具有重要意义。

目前植物中5-羟色胺、色氨酸、褪黑素通常采用薄层色谱法（Thin Layer Chromatography，TLC）[11]、荧光分光光度法（Fluorescence analysis，FL）[11]、分子荧光法（Molecular Fluorescence Spectrometry）[12]、高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）[13-14]或高相液相色谱-串联质谱法（High Performance Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry HPLC-MS/MS）[15]测定。常用固相萃取小柱如C18、HLB等[12-13]进行净化处理。近年来有大量关于分散固相萃取（Disperse solid phase extraction，DSPE）的研究发表，分散固相萃取法是植物中农药分析常用的净化方法，但运用到营养品质检测领域的报道很少。分散固相萃取操作简单，能有效除去样品中的杂质，减少基质干扰。本研究采用分散固相萃取法对香蕉中3种目标物质进行净化处理，并比较了HLB填料、WCX填料和多壁碳纳米管（Multiwalled carbon nanotubes，MWCNTs）的净化效果，其中MWCNTs是一种吸附性能很强的材料，是较为理想的净化填料，能有效降低基质干扰，实现快速准确分析。本研究旨在建立高效液相色谱法测定香蕉中5-羟色胺、色氨酸和褪黑素的分析方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 香蕉品种为巴西蕉、宝岛蕉和南天黄，由海南各香蕉基地提供。成熟的香蕉果肉通过搅拌机处理后，-20 ℃冷冻保藏。

1.1.2 试剂 5-羟色胺、色氨酸、褪黑素标准品（美国Sigma公司），甲醇（色谱纯）（美国Fisher公司），无水乙酸钠（分析纯）（广州化学试剂厂），HLB填料、WCX填料、多壁碳纳米材料（MWCNTs）。

1.2.3 仪器 Waters Alliance e2695型高效液相色谱仪（配有2489紫外检测器） （美国Waters公司），Milli-Q Advantage A10超纯水系统（德国默克密理博公司），Centrifuge CR22N冷冻离心机（日本HITACHI公司），UMV-2多管漩涡混合器（北京优晟联合科技有限公司），T18高速均质机（德国IKA集团），超声波清洗仪，万分之一天平（日本SHIMAZU公司）。

1.2 方法

1.2.1 标准溶液的配制 分别准确称取5-羟色胺、色氨酸、褪黑素各10 mg，用甲醇溶解并定容至100 mL容量瓶中，摇匀，制备成100 mg/L的储备液备用。分别取以上标准品储备液，用甲醇配制成终浓度分别为0.25、0.5、1、2.5、5 mg/L的系列混合标准溶液。

1.2.2 色谱条件 参考宋吉英的条件[16]，色谱柱：Waters SunFire? C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相：0.05 mol/L乙酸钠水溶液（A）-甲醇（B）梯度洗脱，梯度洗脱程序为：95%A-5%B平衡色谱柱，0～30 min，A（%）：95→10，B（%）：5→90；30～31 min，A（%）：10→95，B（%）：90→5，保持5 min；流速0.8 mL/min；柱温25 ℃；检测波长275 nm；进样体积10 μL。

1.2.3 样品处理 准确称取5 g香蕉，均质，加入30 mL甲醇，以2 500 r/min的转速漩涡提取5 min，使目标物质充分浸出，10 000 r/min离心3 min，上清液转入50 mL棕色容量瓶中，残渣再用15 mL甲醇按上述步骤重复提取1次，合并2次提取液，用甲醇定容至50 mL备用。吸取2 mL提取液，加入0.02 g多壁碳纳米材料（MWCNTs），漩涡使提取液得到充分净化，10 000 r/min离心3 min，提取液经0.22 μm微孔滤膜过滤到进样瓶中，待测。

1.2.4 添加回收试验 在香蕉样品中添加一定体积的5-羟色胺、色氨酸和褪黑素的混合标准溶液，按1.2.3的方法提取、净化，按1.2.2条件测定，采用外标法定量，计算回收率及相对标准偏差。设3个不同水平质量浓度，每个添加浓度重复6次。

2 结果与分析

2.1 溶剂及料液比的选择

比较了甲醇、甲醇-水（1：1，V/V）、水作提取溶剂对香蕉中5-羟色胺、色氨酸和褪黑素提取效率的影响。结果表明，甲醇作为提取溶剂效果最佳，详见表1。

确定提取溶剂为甲醇，选择料液比为2：5、1：5、1：7、1：10、1：15，对香蕉进行提取试验。从图1可以看出，提取效率随料液比加大而增加。料液比为1：10时，5-羟色胺、色氨酸、褪黑素的回收率分别为95.6%、95.8%、90.0%。当料液比继续增大时，提取效率增幅不明显。因此，料液比确定为1：10。

2.2 提取方式的选择

比较了超声、漩涡、均质3种提取方式对香蕉中5-羟色胺、色氨酸和褪黑素提取效率的影响。结果表明，与超声提取相比，漩渦提取和均质提取3种目标物质的回收率更好，详见表2。考虑到多管漩涡混合器操作简单，能同时处理多份样品节省操作时间，因此选择漩涡提取。

2.3 净化方法优化

比较了WCX、HLB、MWCNTs三种净化材料对香蕉提取液的净化效果。由图2可知，3种填料对香蕉提取液都有一定净化效果，但是使用HLB填料净化，样品中色氨酸和褪黑素大部分被吸附；使用WCX填料净化，样品中5-羟色胺几乎都被吸附；而使用MWCNTs净化，净化效果好且3种目标物质回收率均符合要求。故选择MWCNTs为净化材料，进一步比较MWCNTs不同用量对目标物质净化效果的影响。由图3可知，用量分别为0.01、0.02、0.03、0.04 g时，目标物质的回收率均高于80%；用量为0.05 g时，目标物质的回收率下降至70%以下。鉴于用量为0.02、0.03、0.04 g时的净化效果优于用量为0.01 g时的，同时为了节约成本，最终选择添加0.02 g MWCNTs净化样品。

2.4 线性范围考察

将质量浓度为0.25、0.5、1、2.5、5 mg/L的3种胺类物质的系列混合标准溶液进行HPLC分析（表3），对各测得值进行相关关系分析和线性回归分析。结果表明：在该浓度范围内，3种目标物质的相关系数都在0.99以上，而且香蕉样品上机溶液浓度也在该浓度范围内，说明该线性范围符合香蕉中5-羟色胺、色氨酸和褪黑素含量的测定。

2.5 准确度和精密度

香蕉中添加5-羟色胺、色氨酸和褪黑素的回收率及相对标准偏差的测定结果见表4。从表4可知，5-羟色胺的3个添加水平的回收率为74.0%～82.2%，相对标准偏差为1.18%～2.19%；色氨酸的3个添加水平的回收率为82.8%～95.2%，相对标准偏差为0.86%～1.55%；褪黑素的3个添加水平的回收率为93.5%～110%，相对标准偏差为1.53%～3.99%。回收率以及相对标准偏差均能满足分析要求，说明该方法能满足分析要求。

2.6 香蕉样品的测定

3个品种香蕉果肉中的5-羟色胺含量在3.76～17.5 mg/kg之间，色氨酸含量在7.76～43.6 mg/kg之间。其中巴西蕉果肉中色氨酸含量略高于南天黄和宝岛蕉，最高能达到43.6 mg/kg。3个品种的香蕉果肉中均未检出褪黑素。标准溶液和香蕉样品的色谱图见图4。

3 讨论

本研究中，甲醇作为提取溶剂效果最佳，推测原因可能有二：一是5-羟色胺、色氨酸、褪黑素的极性较小，具有较高亲脂性，在甲醇中的溶解度大；二是香蕉的含糖量高，同时含有少量蛋白质，这两种物质均易溶于水，不溶于甲醇。根据相似相溶原则，选择甲醇作为提取溶剂，能减少杂质干扰，提高胺类物质萃取效率。

超声波提取法被广泛应用于提取植物中的活性物质，刘定等[15]利用超声波提取芍药中褪黑素并用HPLC-MS/MS对其含量进行分析测定，平均回收率为70.06%；陈晨等[17]利用超声波提取香蕉皮中多酚，提取率为2.931%。本实验比较了超声、漩涡、均质3种提取方式对香蕉中5-羟色胺、色氨酸和褪黑素提取效率的影响，结果表明漩涡提取和均质提取3种目标物质的回收率更好。这可能是因为香蕉含糖量高，黏稠度大，经超声提取的样品在溶剂中分散效果不好，导致样品未能与溶剂充分混合，影响目标物质的回收率。比较漩涡和均质两种方法，漩涡提取回收率略高于均质提取，且多管漩涡混合器操作简单，能同时处理多份样品节省操作时间，因此漩涡提取法适合提取香蕉中胺类物质。

由于香蕉中胺类物质含量较低，且样品中含有多糖、酚类等物质干扰分析，需要对样品进行净化处理，以减少基质干扰，从而提高检测灵敏度。最常用的净化方法是固相萃取。王金英等[13]采用C18小柱对玉米、水稻进行净化处理，测得褪黑素的平均回收率为94.11%；米娟等[18]采用Sep-pak C18柱对植物拟南芥进行净化处理，测得吲哚乙酸的回收率在90.9%～100.9%之间。但固相萃取操作繁琐，溶剂消耗量大，且样品转移导致目标物质损失，影响回收率。近年来分散固相微萃取技术发展迅速，因其操作简便快速的优势而被广泛用于植物中农药分析。本实验比较了WCX、HLB、MWCNTs

3种净化材料对香蕉提取液的净化效果，结果表明MWCNTs净化效果好且3种目标物质回收率均符合要求，原因分析：HLB填料中亲脂性二乙烯基苯保留非极性化合物，色氨酸和褪黑素可能被二乙烯基苯吸附；WCX填料是经过羧基修饰的离子交换型吸附剂，5-羟色胺可能与羧基发生离子交换而被吸附；MWCNTs具有特殊的纳米级孔隙结构，比表面积大，能吸附金属离子、酚类、酯类等物质，但是对胺类物质吸附性小，与固相萃取小柱净化效果相当，且目标物质回收率更高。因此MWCNTs适合作为净化吸附剂用于分析香蕉中胺类物质。

本研究用甲醇作为提取溶剂，涡旋混合可快速提取香蕉果肉中5-羟色胺、色氨酸和褪黑素，提取效率高；用MWCNTs可以有效净化香蕉样品，通过回收率试验证明，该方法准确度、精密度好，能满足香蕉中5-羟色胺、色氨酸和褪黑素的含量测定。

参考文献

[1] 洪佳敏，何炎森，郑云云，等. 香蕉成分及其保健功能研究进展[J]. 中国农学通报，2016，32（10）：176-181.

[2] Kumarasamy Y，Middleton M，Reid R G，et al. Biological activity of serotonin conjugates from the seeds of Centaurea nigra[J]. Fitoterapia，2003，74（6）：609-612.

[3] Jung E S，Kim S B， Kim M H，et al. Inhibitory effects of serotonin derivatives on Adipogenesis [J]. J. Soc. Cosmet. Scientists Korea，2011，37（2）：171-176.

[4] Arzt E，Costas M，Finkielman S，et al. Serotonin inhibition of tumor necrosis factor- alpha synthesis by human monocytes[J] . Life sciences，1991，48 （26）：2 557 - 2 562.

[5] Roh J S，Han J Y，Kim J H，et al. Inhibitory effects of active compounds isolated from safflower （Carthamus tinctorius L. ） seeds for melanogenesis[J] . Biological & pharmaceutical bulletin，2004，27 （12 ）：1 976-1 978.

[6] Betten A，Dahlgren C，Hermodsson S，et al. Serotonin protects NK cells against oxidatively induced functional inhibition and apoptosis[J]. Journal of leukocyte biology，2001，70 （1）：65-72.

[7] Reiter R J，Guerrero J M，Escames G，et al. Prophylactic actions of melatonin in oxidative neurotoxicity[J]. Ann. N Y Acad Sci，1997，825（2）：70-78.

[8] Caroleo M C，Frasca D，Nisticó G，et al. Melatonin as immunomodulator in immunodeficient mice[J]. Immunopharmacology，1992，23（2）：81- 89.

[9] Müller N，Schwarz M J. The immune- mediated alteration of serotonin and glutamate：towards an integrated view of depression[J]. Molecular psychiatry，2007，12 （11）：988-1 000.

[10] 何 煒，李晓晔，石 鑫，等. 褪黑素的生理活性研究进展[J].医药导报，2006，25（6）：556-558.

[11] 雷国强，李厚望. 香蕉中5—羟色胺的荧光测定和薄层鉴定[J]. 中药材，1995，18（3）：142-144.

[12] 高向阳，张凯歌，孔欣欣，等. 分子荧光法分别测定4种野生可食植物中的色氨酸和酪氨酸[J]. 食品科学，2012（22）：231-234.

[13] 王金英，江 川，李书柯，等. 褪黑素测定方法及玉米、水稻种子中褪黑素含量的分析研究[J]. 中国农学通报，2009，25（17）：20-24.

[14] 赵建芬，杨海贵，李静仪. HPLC-UV法检测芦荟、枸杞叶和桑叶中的褪黑素[J]. 食品工业，2015，36（2）：266-270.

[15] 刘 定，赵大球，陆春良，等. 采用高效液相色谱-串联质谱法检测芍药中褪黑素含量[J]. 分子植物育种，2017，15（4）：1 527-1 534.

[16] 宋吉英. HPLC法测玉米蛋白粉和乳猪教槽料中色氨酸的含量[J]. 饲料工业，2013，34（7）：52-54.

[17] 陈 晨，胡文忠，田沛源，等. 超声辅助提取香蕉皮多酚工艺优化及其抗氧化性的分析[J]. 食品科学，2014，35（2）：12-17.

[18] 米 娟，周 敏，丁 兰，等. 固相萃取-化学发光法测定植物中的吲哚乙酸[J]. 分析试验室，2011，30（8）：44-47.