海洋放线菌Streptomyces sp. HNWSW—49的次生代谢产物研究

吉才娟 王佩 梅文莉 黄小龙 戴好富

摘 要 对1株具有抗芒果炭疽病菌活性的海口湾海泥来源放线菌Streptomyces sp. HNWSW-49发酵液的化学成分进行研究。采用多种色谱技术对化合物进行分离纯化，以波谱数据确定化合物的结构。从来源于海口湾海泥的放线菌Streptomyces sp. HNWSW-49发酵液的乙酸乙酯提取物中分离鉴定了7个含氮化合物，分别为：环-（苯丙-丙）二肽（1），环-（亮-甘）二肽（2），环-（苯丙-缬）二肽（3），环-（羟脯-苯丙）二肽（4），N-（2-苯基）乙酰胺（5），β-腺苷（6），和2-哌啶酮（7）。所有化合物均为首次从该放线菌中分离得到，其中化合物6为首次从微生物中分离得到。

关键词 海泥；放线菌；化学成分；含氮化合物

中图分类号 R931.77 文献标识码 A

Abstract The chemical constituents from the fermentation broth of Streptomyces sp. HNWSW-49， which was isolated from the sediment of Haikou Bay and showed anti-fungal activity against Colletotrichum gloeosporioides in postharvest Mango， was studied. Seven compounds were isolated with various chromatographic techniques. Meanwhile， the structures of the compounds were identified through a combined analysis of physicochemical properties and spectroscopic evidence. They were determined as ascyclo-（Phe- Ala） （1）， cyclo-（Leu-Gly）（2）， cyclo-（Phe- Val） （3）， cyclo-4-OH-Pro-Phe （4）， N-（2-phenylethyl） acetamide（5）， β- Adenosine（6）， and 2-Piperidone（7）. The compounds were obtained from the Streptomyces sp. HNWSW-49 for the first time， while 6 was the first time isolated from microorganisms.

Key words marine sediment； Streptomyces sp. ； chemical constituents； nitrogenous compounds

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.04.023

海洋占整个地球表面积的71%，其具有低温、高压、高盐等特殊环境，且生物多样性远超陆地，是一個巨大的生物资源来源地。海洋特殊的生存环境，使得海洋生物形成了有别于陆生生物的新陈代谢途径、生存繁殖方式和适应机制，从而产生结构独特、具有多种生物活性的次级代谢产物。在对近3年的海洋微生物来源的新化合物统计时，发现海洋微生物新天然产物的结构类型多样，其中含氮化合物占总的新天然产物的37%，且含氮化合物的活性率最高[1]。可见，含氮化合物是活性天然产物的重要来源，其药理活性主要有抗菌作用、抗病毒作用、抗肿瘤作用等[2-10]。在前期化学筛选中，笔者发现从海泥中分离的放线菌HNWSW-49发酵产物乙酸乙酯萃取物含有丰富的含氮化合物。为了探索该系列化合物，本研究对放线菌HNWSW-49进行了大批量发酵，并对其次级代谢产物的化学成分进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源 放线菌HNWSW-49分离自海口湾海泥。菌种保藏于中国热带农业科学院热带生物技术研究所。

1.1.2 仪器与试剂 Polar-L型旋光仪（Catacro Co. Ltd），Bruker AV-600（TMS内标）核磁共振波谱仪（Bruker），Autospec 300质谱仪（Bruker），旋转蒸发仪（Heidolph Laborota），高压湿热灭菌锅（Sanyo），CO2培养箱（RSBiotech Ltd.），Sephadex LH- 20（Merck公司），反相材料C-18（FU-JI公司）、柱色谱硅胶和薄层色谱硅胶（青岛海洋化工厂产品），Waters1525高效液相色谱仪（Dionex），Waters C18半制备柱（250 mm×10 mm，5 μm）（Cosmosil）；提取分离用试剂甲醇、乙醇、石油醚乙酸乙酯等试剂（工业纯重蒸），多菌灵（上海生工有限公司）等。

1.1.3 培养基 马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）[11]：葡萄糖20.0 g，马铃薯200.0 g，琼脂20.0 g，蒸馏水1 L；YE培养基（g/L）：葡萄糖4.0 g，麦芽浸粉10.0 g，NaCl 16.5 g，酵母浸膏4.0 g，琼脂粉20.0 g；放线菌2号培养基（g/L）：玉米浆3.0 g，葡萄糖20.0 g，淀粉10.0 g，酵母浸膏4.0 g，蛋白胨2.0 g，牛肉膏3.0 g，NaCl 30.0 g，K2HPO4 0.5 g，（NH4）2SO4 0.5 g，MgSO4 0.5 g，CaCl2 0.5 g，CaCO3 2.0 g。

1.2 方法

1.2.1 菌株鉴定 接种放线菌HNWSW-49于YE培养基上，28 ℃培养7 d，观察菌株的形态特征。同时提取该菌株的DNA序列为模板，采用7F（5'-CAGAGTTTGATCCTGGCT-3'）和1540R（5'-AGGAGGT- GATCCAGCCGCA -3'）细菌通用引物进行PCR扩增，并对PCR扩增所得产物进行纯化。之后，送往生物工程（上海）股份有限公司对该菌株16S rDNA基因序列进行测定。将测序得到的放线菌16S rDNA基因序列在http：//www.ezbiocloud.net/进行在线序列比对，并利用软件MEGA6.06构建系统发育树进行分析。

1.2.2 菌株发酵 在超净工作台中，将菌株HNWSW-49放于YE培养基中活化后，切取黄豆大小的菌块接种于装有200 mL放线菌2号培养基的500 mL摇瓶中，置于28 曟，180 r/min的三角瓶中振荡培养11 d，共发酵200瓶。

1.2.3 菌株化学成分的提取与分离 菌株纯化发酵结束后，合并发酵液，向发酵液中加入40 L乙酸乙酯，用超声破碎仪进行菌体细胞的破碎，合并乙酸乙酯层，减压浓缩后，采用减压/加压正反相硅胶柱色谱、凝胶（Sephadex LH-20）柱色谱及制备型HPLC等分离技术，对菌株次生代谢产物进行分离；通过波谱数据分析，结合理化常数对化合物的结构进行鉴定。

1.2.4 抗菌活性测试 平板对峙试验参照文献[12]的方法进行。采用滤纸片琼脂扩散法[13]对单体化合物的抗菌活性进行测试。芒果炭疽病菌采用PDA培养基进行培养。将样品溶于氯仿甲醇混合溶液中，配制成终浓度为20 g/L的样品溶液，取25 μL样品溶液滴加于事先准备好的灭菌滤纸片上，待溶剂挥发纸片完全干燥后，将其贴于涂有100 μL测试菌悬液（菌液浓度105～107 cfu/mL）的培养皿中。将培养皿置于培养箱中进行培养，芒果炭疽病菌（多菌灵为阳性对照）于28 ℃条件下培养，12 h后观察抑菌情况，并测量抑菌圈直径进行记录，以氯仿甲醇混合溶液作为阴性对照。

2 结果与分析

2.1 菌株HNWSW-49鉴定结果

放线菌HNWSW-49在YE固体培养基平板上生长良好。在生长初期，该菌株为白色菌落，随着培养时间的延长，该菌株表面变得干燥并呈现褶皱状。随后，产生大量孢子覆盖于菌落表面，形成绿色菌落（图1）。

测序结果显示，获得该菌株的16S rDNA基因序列长度为1 440 bp。序列比对表明，该菌株与Streptomyces osmaniensis的相似度为99.08%。选择序列相似度较高的标准菌株与该菌株构建系统进化发育树，发现该菌株与链霉菌Streptomyces osmaniensis聚在同一分支上（图2），但进化距离较远，说明该菌株极有可能为一个新种。因此，将该菌株初步鉴定为链霉菌属的放线菌。

2.2 芒果炭疽病菌拮抗放线菌的筛选

以芒果炭疽病菌作指示菌，采用对峙培养法，对分离自海口湾海泥的100株放线菌进行拮抗活性初筛。由图3可知，菌株HNWSW-49表现出良好的抑菌效果。提取菌株HNWSW-49的发酵代谢产物，作进一步的抑菌筛选试验。结果表明，菌株HNWSW-49发酵液的乙酸乙酯提取物对芒果炭疽病菌的生长并未表现出拮抗作用。

2.3 化合物的分离及结构鉴定

2.3.1 化合物的分离 菌株的乙酸乙酯提取物（8.2 g）经减压硅胶柱色谱，以石油醚-氯仿和氯仿-甲醇为流动相梯度洗脱，得到11个流份（Fr. 1～Fr. 11）。Fr. 4（2.1 g）经RP-18柱色谱，以甲醇-水梯度洗脱得到38个流份（Fr. 4-1～Fr. 4-38）。Fr. 4-9、Fr. 4-10结晶，经甲醇洗净后分别得化合物3（3.0 mg）、5（11.9 mg）。Fr. 4-2（389.8 mg）分别以甲醇-氯仿（体积比为1﹕1）和纯甲醇为流动相，经Sephadex LH-20凝胶柱色谱进行分离，再经高效液相色谱（C18柱）以25%甲醇-水为流动洗脱得到化合物1（tR 13.0 min，2.2 mg）、2（tR 9.8 min，1.0 mg）、4（tR 12.7 min，1.8 mg）和7（tR 6.8 min，9.9 mg）；Fr. 9（688.1 mg）经RP-18柱色谱，以甲醇-水梯度洗脱得到40个流份（Fr. 9-1～Fr. 9-40）。Fr. 9-1（271.4 mg）分别以甲醇-氯仿（体积比为1﹕1） 和纯甲醇为流动相，经Sephadex LH-20凝胶柱色谱进行分离，再经高效液相色谱（πNAP柱）以5%乙腈-水为流动相洗脱得到化合物6（tR 6.2 min，1.0 mg）。

2.3.2 化合物的鉴定 化合物1：白色粉末状，[α]D20 = 22.6（c= 0.07，MeOH），ESI-MS m/z241处给出[M+Na]+峰，结合1H-NMR、13C-NMR和DEPT数据推测该化合物分子式为C12H14N2O2。1H-NMR（DMSO-d6，500 MHz）δ：8.12（1H，s，NH），8.02（1H，s，NH），7.27（2H，t，J=7.2 HZ，H-10，H-12），7.22（1H，t，J=7.2 Hz，H-11），7.14（2H，d，J=6.9 Hz，H-9，H-13），4.17（1H，m，H-5），3.61（1H，q，J=7.0 Hz，H-2），3.12（1H，dd，J= 3.7，13.4 Hz，H-7），2.85（1H，dd，J=5.0，13.4 Hz，H-7），0.44（3H，d，J=7.0 Hz，H-14）；13C-NMR（DMSO-d6，125 MHz）δ：49.8（C-2），167.8（C-3），55.5（C-5），166.0（C-6），38.4（C-7），136.1（C-8），130.5（C-9，C-13），128.2（C-10，C-12），126.8（C-11），19.8（C-14）。根据波谱数据和理化性质分析，结合文献[14]比对，化合物1被确定为环-（苯丙-丙）二肽，即cyclo-（Phe-Ala）。

化合物2：白色粉末状，[α]D20 = 6.0（c= 0.95，MeOH），ESI-MS在m/z 339处给出[2M-H]-峰，結合1H-NMR、13C-NMR和DEPT数据推测该化合物分子式为C8H14N2O2。1H-NMR（CD3OD-d4，500 MHz）δ：4.01（1H，d，J= 17.8 Hz，H-5），3.90（1H，dd，J=5.5，8.1 Hz，H-2），3.83（1H，d，J=17.8 Hz，H-5），1.83（1H，m，H-8），1.68 （2H，m，H-7），0.98（3H，d，J= 6.6，H-9），0.96（3H，d，J = 6.6，H-10）；13C-NMR（CD3OD-d4，125 MHz）δ：54.8（C-2），171.6（C-3），45.2（C-5），168.9（C-6），43.8（C-7），25.3（C-8），23.4（C-9），22.1（C-10）。根据波谱数据和理化性质分析，结合文献[14]比对，化合物2被确定为环-（亮-甘）二肽，即cyclo-（Leu-Gly）。

化合物3：白色粉末状，[α]D20 = 10.6（c = 0.15，MeOH），ESI-MS m/z 245处给出[M-H]-峰，结合1H-NMR、13C-NMR和DEPT数据推测该化合物分子式为C14H18N2O2。1H-NMR（DMSO-d6，500 MHz）δ：8.06（1H，s，NH），7.90（1H，s，NH），7.25-7.15（5H，overlap，H-9，H-10，H-11，H-12，H-13），4.20（1H，dd，J= 3.2，7.8 Hz，H-5），3.52（1H，m，H-2），3.14（1H，dd，J= 4.3，13.5 Hz，H-7），2.86（1H，dd，J= 5.0，13.5 Hz，H-7），1.69（1H，m，H-14），0.64（3H，d，J=7.1 Hz，H-16），0.25（3H，d，J= 6.8 Hz，H-15）；13C-NMR（DMSO-d6，125 MHz）δ：59.2（C-2），166.4（C-3），55.0（C-5），166.6（C-6），37.8（C-7），136.3（C-8），127.9 （C-9，C-13），130.3（C-10，C-12），126.5（C-11），31.0（C-14），16.2（C-15），18.2（C-16）。根据波谱数据和理化性质分析，结合文献[15]比对，化合物3被确定为环-（苯丙-缬）二肽，即cyclo-（Phe-Val）。

化合物4：白色粉末状，[α]D20 = -41.0（c= 0.15，MeOH），ESI-MS m/z 283处给出[M+Na]+峰，结合1H-NMR、13C-NMR和DEPT数据推测该化合物分子式为C14H16N2O3。1H-NMR（DMSO-d6，500 MHz）δ：7.29-7.20（5H，m，H-9，H-10，H-11，H-12，H-13），4.47（1H，dt，J = 3.3，5.0 Hz，H-5），4.35（1H，ddd，J= 1.7，6.0，11.8 Hz，H-2），4.26（1H，m，H-15），3.69（1H，dd，J=5.1，13.1 Hz，H-16），3.27（1H，dd，J= 8.4，13.1 Hz，H-16），3.15（2H，dd，J = 2.4，5.1 Hz，H-7），2.05（1H，dd，J=5.9，13.0 Hz，H-14），1.35（1H，dd，J=4.2，13.0 Hz，H-14）；13C-NMR（DMSO-d6，125 MHz）δ：58.3（C-2），171.2（C-3），57.6（C-5），167.1（C-6），38.8（C-7），137.3（C-8），129.5（C-9，C-13），131.0（C-10，C-12），128.1（C-11），38.0（C-14），68.5（C-15），55.2（C-16）。根据波谱数据和理化性质分析，结合文献[16]比对，化合物4被确定为环-（羟脯-苯丙）二肽，即cyclo-4-OH-Pro-Phe。

化合物5：黄色油状，ESI-MS在m/z 202处给出[M+Na]+峰，结合1H-NMR、13C-NMR和DEPT数据推测该化合物分子式为C10H13NO2。1H-NMR（CD3OD-d4，500 MHz）δ：7.89（1H，s，NH），7.02（2H，d，J= 8.6 Hz，H-5，H-9），6.71（2H，d，J= 8.6 Hz，H-6，H-8），3.33（2H，t，J=7.5Hz，H-2），2.68（2H，t，J= 7.5 Hz，H-3），1.90（3H，s，H-11）；13C-NMR（CD3OD-d4，125 MHz）δ：42.4（C-2），35.6（C-3），131.2（C-4），130.7（C-5，C-9），116.2（C-6，C-8），156.9（C-7），173.2（C-10），22.5（C-11）。根据波谱数据和理化性质分析，结合文献[17]比对，化合物5被命名为N-（2-苯基）乙酰胺。

化合物6：黄色油状，ESI-MS在m/z 290处给出[M+Na]+峰，结合1H-NMR、13C-NMR和DEPT数据推测该化合物分子式为C10H13N5O4。1H-NMR（DMSO-d6，500 MHz）δ：8.34（1H，s，H-8），8.13（1H，s，H-2），7.34（2H，s，NH2），5.87（1H，d，J=6.2 Hz，H-10），4.60（1H，t，J=5.5 Hz，H-11），4.14（1H，m，H-12），3.96（1H，m，H-13），3.67（1H，dd，J=12.0，4.2 Hz，H-14），3.55（1H，br d，J=12.0 Hz，H-14）；13C-NMR（DMSO-d6，125 MHz）δ：152.5（C-2），149.1（C-4），119.4（C-5），156.2（C-6），140.0（C-8），88.0（C-10），73.5（C-11），70.7（C-12），86.0（C-13），61.7（C-14）。根据波谱数据和理化性质分析，结合文献[18]比对，化合物6被鉴定为β-腺苷。

化合物7：黄色油状，结合1H-NMR、13C-NMR和DEPT数据推测该化合物分子式为C5H9NO。1H-NMR（DMSO-d6，500 MHz）δ：3.27（2H，t，J=5.8 Hz，H-6），2.30（2H，t，J=6.5 Hz，H-3），1.81（2H，m，H-4），1.75（2H，m，H-5）；13C-NMR（DMSO-d6，125 MHz）δ：175.0（C-2），32.0（C-3），21.7（C-4），23.0（C-5），42.9（C-6）。根据波谱数据和理化性质分析，结合文献[19]比对，化合物7被确定2-哌啶酮。

化合物1～7的结构式见图4。

3 结论

本研究从分离自海口湾海泥的100株放线菌中筛选出1株芒果炭疽病菌的拮抗放线菌StReptomyces sp. HNWSW-49，并从菌株HNWSW-49发酵液的乙酸乙酯提取物中分离鉴定了7个含氮化合物。其中4个环二肽类化合物，2個酰胺类化合物和1个核苷类化合物。活性测试结果表明，Streptomyces sp. HNWSW-49发酵液的乙酸乙酯提取物及从中分离得到的7个含氮化合物都没有表现出抗芒果炭疽病菌的活性，原因可能是Streptomyces sp. HNWSW-49抗指示病菌而不是其代谢产物，也可能是其代谢产物有抗目标病菌的生物活性，但是活性成分不溶于乙酸乙酯相，所以找不到抗目标病菌活性成分。查文献发现环二肽类化合物具有广泛的生物活性，如抗菌[20]、抗肿瘤[21]、抗真菌[22]等。酰胺类化合物多用于除草、杀虫及杀菌[23]；核苷类成分是生物细胞维持生命的重要物质，具有免疫调节、调节中枢神经以及改善脑细胞代谢等多种生理活性，一些核苷类药物在医疗上多用于抗肿瘤和抗病毒治疗[24-26]。化合物2具有吗啡耐受性[27]，4具有很强的体外抗肿瘤活性[28]，6可以促进食用菌的产量[18]。本研究表明，海洋放线菌是含氮化合物产生的重要菌源，但这些含氮化合物的应用价值还有待深入研究。