黄皮白肉火龙果快繁体系的建立

李羽佳 唐文 魏卿 林妃 李凯 金志强

摘 要 黄皮白肉火龙果，又名麒麟果，为建立其快繁体系，本研究选取种子萌发长出的茎段为外植体，研究其不同消毒时间、不同浓度激素配比对其愈伤组织及芽的诱导、增殖继代、根生长的影响。结果表明：用无水乙醇灭菌40 s后，再用5%次氯酸钠溶液灭菌10 min，种子萌发率最高可达97%。愈伤组织及不定芽诱导培养基最佳配方为1/2 MS+2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA，芽的诱导率最高可达97%；利用MS+2.0 mg/L 6-BA+3.0 mg/L NAA培养基进行增殖、继代培养的效果最佳，增值系数最高为4.6；在MS培养基中添加2.0 mg/L IBA，可最大程度地促进根的生长。

关键词 火龙果；组织培养；萌发率

中图分类号 S682.33 文献标识码 A

Abstract Selenicereus megalanthus is also known as yellow pitahaya. In order to establish a system of Selenicereus megalanthus tissue culture and rapid propagation， seed germination stem segments were used as the explants， and the effects of different disinfection time， different concentrations of hormones were studied on the callus germination， propagation， and the growth of the root. The result indicated that the germination rate was 97% by sterilization with pure ethanol in 40 s， 5% hypochlorite in 10min. The suitable medium for callus germination was 1/2 MS+2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA， and the germination rate was 97%； The best medium for proliferation was MS+2.0 mg/L 6-BA+3.0 mg/L NAA， and the proliferation coefficient was 4.6； The best medium for rooting was MS+2.0 mg/L IBA.

Key words Selenicereus megalanthus； tissue culture； germination rate

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.04.016

火龍果（Hylocereus undnlates Britt. & Rose），又名仙蜜果或红龙果，其营养丰富、畏寒耐旱[1-3]，大部分属于仙人掌科量天尺属[Hylocereus （Berger）Britt.et Rose]，小部分属于蛇鞭柱属（Seleniereus meja-lantous）[4]。大体上可分为红皮红肉、红皮白肉、黄皮白肉等3种类型。黄皮白肉种[S.megalanthus （K.schumann ex Vaupel） Ralf Bauer]火龙果是近几年新兴的品种，又名麒麟果，原产于中美洲。其果实较小，种子较大，无果腥味，果实甜度高达18度以上，富含丰富的花青素和一般植物少有的水溶性膳食纤维，又因其品质优良、产量小等特点，致其经济价值远远高于其他类型火龙果。近年来，关于火龙果的研究主要集中在种植资源引进、栽培及生物学特性、贮藏保鲜技术、色素提取等方面，对火龙果分子生物学、细胞生物学、植物病害等方面的研究相对较少，而有关火龙果的新品种选育、采后生理、产品加工及需肥特性等方面的研究相当有限[5-7]。植物组织培养具有栽培条件可人为控制、成长周期短、增值率高、管理方便、利于工厂化生产等特点，可快速获得优质、生长均一、低毒、形状稳定的植物幼苗，且在分子育种、植物抗性分析等研究方面具有重要作用。火龙果快繁体系研究多采用茎段、实生幼苗、花药[8]等为外植体，近年来，又开展了针对特定品种火龙果组织培养方面的研究[9-10]。

建立黄皮白肉火龙果快繁体系是解决生产中单果体积小、产量低、挂果时间长、种苗稀缺且实生苗性质不稳定等问题的关键，是改变国内黄皮白肉火龙果稀缺、无法形成种植产业化等现状的根本途径。鉴于此，本研究选用实生茎段为外植体建立快繁体系，为火龙果新品种选育、微嫁接技术的应用与推广、黄皮白肉火龙果工厂化生产及火龙果产业发展奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试所用黄皮白肉火龙果种子来自于中国热带农业科学院组培厂。选择播种一个月后生长均一健康的茎段作为试验材料。

1.2 方法

1.2.1 外植体的选取及消毒处理 选取高度成熟的黄皮白肉火龙果种子，先用流水清洗干净杂质，接着用75%无水乙醇分别浸泡20 s、40 s、1 min，然后用无菌水清洗3～5次，再使用5%次氯酸钠溶液消毒5、10、15 min，最后用无菌水清洗3～5次。清洗干净后晾干，接种于MS培养基中，每个处理播种10瓶，每瓶接种10颗种子，先暗培养10 d，当种子发芽后立刻移至温度（25±2）℃、每天在光照12 h下继续培养20 d，当幼苗生长至1.5～2 cm时备用。

1.2.2 愈伤组织及不定芽诱导培养 切去幼苗根部及子叶部分，将幼茎切成1 cm左右茎段并垂直接种于培养基上。以MS、1/2 MS为基础培养基，然后分别添加NAA（浓度为0.5、1.0、1.5 mg/L）、6-BA（浓度为1、2、3 mg/L）、琼脂10 g/L、蔗糖30 g/L，培养基pH值为5.9。每个编号培养基接种10瓶，每瓶接种4段茎段。将茎段置于温度（25±2）℃、光照12 h/d、光照强度1 500～1 800 lx环境中培养30 d，最后统计愈伤组织数及不定芽的诱导率。诱导率=愈伤组织数/接种数×100%。

1.2.3 增殖继代培养 当幼芽长至1～1.5 cm时切除愈伤组织部分，将其切成1 cm左右的茎段接种于增殖培养基中，以MS为基础培养基，分别添加6-BA（浓度为1、2、3 mg/L）、NAA（浓度为1、2、3、4mg/L），再添加琼脂10 g/L、蔗糖30 g/L，培养基pH值为5.9。每个编号培养基接种10瓶，每瓶接种4段茎段，在温度（25±2）℃、光照16 h/d、光照强度1 500～1 800 lx环境中培养20 d后，最后统计增殖率。增值率=形成的有效苗数/接种数×100%。

1.2.4 生根培养 当幼芽生长到3～4 cm时，将芽体切下，放置于MS培养基中， 分别添加浓度为0.5、1、2、3 mg/L IBA，再添加琼脂10 g/L、蔗糖30 g/L，培养基pH值为5.9。每个编号培养基接种20瓶，每瓶接种1个幼芽，于温度（25±2）℃、光照12 h/d、光照强度1 500～1 800 lx环境中培养20 d，最后统计生根率。生根率=幼苗生根数/接种数×100%。

1.3 数据分析

每个处理重复3次，并采用DPS（Date Processing System）軟件对试验所得数据进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 外植体选取及消毒处理

由表1可知，当无水乙醇灭菌时间为20 s时，发芽率随次氯酸钠浓度的升高而升高；当无水乙醇灭菌时间为40 s时，染菌数基本为0；当次氯酸钠消毒时间为10 min时，发芽率最高；当无水乙醇灭菌时间为60 s时，染菌数依然为0，但发芽率很低。综上所述，处理5即无水乙醇灭菌40 s、5%次氯酸钠溶液灭菌10 min时，发芽率最高为97%，因此可将此处理作为最佳处理方案。

2.2 愈伤组织诱导培养

由表2可知，以MS为基础培养基的处理中，愈伤组织及不定芽诱导率均低于1/2 MS培养基。诱导率随NAA浓度的升高而升高，当NAA浓度为1.0 mg/L时诱导率最高，继续升高浓度时愈伤组织褐变率升高。而当NAA浓度不变、6-BA浓度为2.0 mg/L时，诱导率高于其他处理。综上所述，最佳激素浓度组合为1/2 MS+1.0 mg/L NAA+2.0 mg/L 6-BA。

2.3 增殖继代培养

由表3可知，增值系数随6-BA浓度的升高而升高，当浓度为3.0mg/L时增值率不再升高，与浓度为2.0 mg/L时基本相同，且增殖芽体明显比浓度为2.0 mg/L时长势弱。当NAA浓度为3.0 mg/L时，增值系数最高，且生长耗时短长势旺（图1）。综上所述，最佳增值培养基为：MS+2.0 mg/L 6-BA+3.0 mg/L NAA+10 g/L琼脂+30 g/L蔗糖，pH值为5.9。

2.4 生根培养

由表4可知，每个处理均可生根，且生根数随IBA浓度的增加而增加，当IBA浓度为2.0 mg/L时，生根数最多（图2）；当IBA浓度为3.0 mg/L时，根变瘦弱并有气生根生成。综上所述，最佳配方为：MS+2.0 mg/L IBA。

3 讨论

利用无菌种胚所发幼芽作为外植体，成功的避免了成熟茎段做为外植体易带菌、易污染等缺点，且具有再生能力强、长势均一等优点[10-11]。本研究当无水乙醇消毒时间为20 s时，消毒时间过短，种子发芽易染菌；当消毒时间为60 s时，种子发芽率大幅降低，可能由于无水乙醇对种子造成了毒害，或抑制了种胚正常的新陈代谢和细胞分裂。而当无水乙醇消毒时间相同次氯酸钠消毒时间变化时，发芽率变化并不大，这说明影响种子消毒的主要因素为无水乙醇消毒处理，而最佳的处理时间为无水乙醇消毒40 s，5%次氯酸钠消毒20 min。

在试验中使用不同剂量、不同种类生长素和细胞分裂素是试验成功的关键[12-14]。本研究利用不同浓度6-BA、NAA及IBA建立了黄皮白肉火龙果的快繁体系，最佳诱导培养基配方为1/2 MS+2.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA，诱导率可达97%。在前人研究中，火龙果外植体诱导多运用激素NAA及6-BA完成，少部分研究使用ZT与IBA。王云山等[15]、洪青梅等[16]选用“金都一号”等品种带刺座茎段为外植体，使用4.0 mg/L 6-BA +0.1 mg/L NAA对火龙果进行诱导，诱导率分别为75%、80%。这可能由于不同供试材料及外植体的选择导致了结果出现差异[17]。本研究以MS+2.0 mg/L 6-BA +3.0 mg/L NAA培养不定芽，芽的增值系数最高为4.6。而张岭等[18]以MS+9.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA为增值培养基，其增值系数最高可达12，这可能还与继代时间、继代次数、培养条件等因素有关。

黄皮白肉火龙果为新兴品种，学者对其研究较少，相比于红皮红肉、红皮白肉等品种在外观形态及生理特性上均存在一定的差距[19-20]。洪青梅等[16]、黄春华等[21]、刘小翠等[9]利用“金都一号”、“蜜宝”、“贵州B7”3个不同品种分别建立了火龙果快繁体系，在激素的运用及配比、诱导率及增值率等方面皆与本研究不尽相同。本研究建立了黄皮白肉火龙果的快繁体系，解决了种苗稀缺及植株易染病等问题，但从组培苗生长成苗仍需很长一段时间，如何减少时间成本、保证其遗传稳定性等问题仍需进一步研究。

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