三羟基异黄酮对脂肪酸氧化关键酶的调控研究

代子玲 范远景 杨登玲 徐柳 童金柱 娄鹏翔

摘要 [目的]探讨三羟基异黄酮（Genistein， Gen）对非酒精性脂肪肝病（NAFLD）模型中脂肪酸β氧化限速酶肉碱棕桐酰转移酶1（Carnitine acetyltransferase 1，CPT-1）的调节作用。[方法]油酸诱导细胞建模，实时荧光定量PCR测定三羟基异黄酮处理后细胞中过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARα）和CPT-1的mRNA相对表达量。[结果]Gen能经由PPARs途径上调CPT-1 mRNA的表达。 [结论]该研究为三羟基异黄酮在临床药理上的应用以及非酒精性脂肪肝的预防治疗和药物研究提供了试验依据。

关键词 三羟基异黄酮；非酒精性脂肪肝病；过氧化物酶体增殖物激活受体α； 肉碱棕桐酰转移酶

中图分类号 S188文献标识码 A文章编号 0517-6611（2018）16-0097-03

Abstract [Objective]To investigate the regulatory mechanism of Genistein on CPT1， a key ratelimiting enzyme of fatty acids in NAFLD model. [Method]The expression of mRNA PPARα and CPT1 were measured by realtime fluorescence quantitative PCR. [Result] Gen can regulate the mRNA expression of CPT1 through via PPARs pathway. [Conclusion]The study provides a test basis for the application of Genistein in clinical pharmacology and the prevention and treatment of NAFLD.

Key words Genistein；NAFLD；PPARα；CPT1

三羟基异黄酮（Genistein， Gen）是大豆异黄酮的主要活性成分，特有的类似雌激素的化学结构，使其具有多种分子学效应，表现在影响癌变、肥胖、骨质疏松和代谢综合征等方面，在预防和治疗常见疾病方面起着重要作用[1]。相关研究表明Gen能广泛参与调控人体脂质代谢、脂肪酸代谢等多种生理学活动，对脂质代谢有关的基因进行调控，调节脂肪细胞合成与分化，改善脂质代谢[2]。非酒精性脂肪肝病（Non-alcoholic fatty liver disease， NAFLD）是一种由多种因素共同作用产生的慢性肝类疾病，虽无过量饮酒，但伴随肝细胞变性和脂肪沉积等症状[3]，其发病率正在逐年提高，已经引起了国内外的重视[4-5]。研究表明NAFLD在人群中的流行率为20%～30%，且在成人和高工业化的国家中发病率更高[6]。过氧化物酶体增殖物激活受体α（Peroxisome proliferatorsactivated receptors α，PPARα）、肉碱棕桐酰转移酶（Carnitine acetyltransferase 1， CPT-1）分别是脂肪酸氧化过程中的关键转录因子和关键限速酶，CPT-1是PPARα的重要下游靶基因[7]。脂肪酸氧化异常是NAFLD的重要发病因素之一，NAFLD作为一种常见的肝病，通常伴随着游离脂肪酸水平过高、甘油三酯沉积等一系列症状[8]。目前，NAFLD对人们的健康有着严重威胁，但国际机构迄今尚未批准任何药物作为治疗非酒精性脂肪肝的公开药品，研制与开发治疗非酒精性脂肪肝药物和治疗手段迫在眉睫[9]。笔者研究了Gen对脂肪酸氧化的调控作用，对预防和开发NAFLD药物具有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验细胞。试验用到的细胞包括人肝癌细胞HepG2、人肝癌细胞Hep3b、人正常肝细胞L-O2、小鼠前脂肪细胞3T3-L1，均購自中国科学院体外典型培养物保存委员会上海细胞库。

1.1.2 主要仪器。HH.CP-01W型二氧化碳细胞培养箱（上海博远实业有限公司）；BDS 200型倒置显微镜（重庆奥特光学仪器公司）；超净工作台（苏州净化技术公司）；CT14RD高速冷冻离心机（Beckman Coulter）；DYY-6C型电泳仪（北京六一仪器厂）； iQTM5多重实时荧光定量 PCR仪（Bio-Rad 公司）。

1.1.3 主要试剂。三羟基异黄酮（Gen）、非诺贝特（F），购自上海生工；油酸（OA），购自SigmaAldrich；DMEM、RPMI 1640培养基，购自上海普飞生物公司； IBMX、地塞米松、胰岛素，购自Cay Chemical；反转录试剂盒、实时荧光定量PCR试剂盒，购自南京诺唯赞生物科技有限公司。

1.1.4 引物设计。从NCBI上获取人和小鼠CPT-1、HMGCS1、ACC基因序列，使用IDT（Integrated DNA Technologies）进行引物的设计，利用NCBI/BLAST对引物进行特异性校对。人CPT-1 F： CAGCAAGTGGAGCTGTTTGA，R： TGAGGTTCTCTCCCACAAGG； 小鼠CPT-1 F：GATGTGGACCTGCATTCCTT，R：TCCTTGTAATGTGCGAGCTG；人β-actin F：AGCCATGTACGTAGCCATCCA，R：TCTCCGGAGTCCATCACAATG；小鼠β-actin F：ACGAGGCCCAGAGCAAGAG，R：GGTGTGGTGCCAGATCTTCTC。试验所用的实时荧光定量PCR引物是由上海生工提供。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及分组处理。

1.2.1.1 细胞培养。按照90 mL（DMEM），胎牛血清（FBS）10 mL，青链霉素混合溶液1 mL（购自上海生工）比例配制完全培养基。细胞复苏后，次日换液，当培养瓶底面有70%～85%细胞覆盖时即进行1∶2传代。观察细胞生长状态，2 d传代1次，当细胞状态稳定时，可用于后续试验。小鼠前脂肪细胞3T3-L1需诱导分化为成熟的脂肪细胞才能进行后续试验。3T3-L1的成熟诱导分化主要步骤：①取生长状态良好的对数期3T3-L1接种于细胞板，放于37 ℃、5%二氧化碳恒温培养箱中培养过夜；②加入分化液I（含0.5 mmol/L IBMX、1 μmol/L地塞米松、5 mg/L胰岛素的高糖培养基）于培养箱中培养；③48 h后，换用诱导分化液Ⅱ（含5 mg/L胰岛素的高糖培养基）进行培养 ；④每隔48 h换诱导分化液 Ⅱ 1次，12 d左右基本诱导分化为成熟脂肪细胞，可用于后续试验。

1.2.1.2 细胞分组。将对数期细胞种于12孔板，培养过夜。1 mmo/L油酸诱导24 h后进行加药处理，试验分为空白组（Control）；模型组（1 mmol/L OA）； Gen组（0、15、30、60、120 μmol/L）、阳性对照PPARα激动剂非诺贝特（F）组（10、20 μmol/L）。

1.2.2 细胞总RNA提取及反转录。细胞加药后置于37 ℃、5%二氧化碳恒温培养箱中培养24 h，收集细胞进行后续总RNA的提取，细胞RNA提取采用Trizol法。按照 cDNA 反转录试剂盒的说明书要求将提取的RNA反转录为cDNA，使用紫外核酸检测仪测定RNA浓度。

1.2.3 荧光定量PCR检测。实时荧光定量PCR体系为20 μL：Fast SYB R Mixture 10 μL；上下游引物各0.4 μL；模板cDNA 2 μL；RNase-Free ddH2O 7.2 μL。实时荧光定量PCR的反应程序：95 ℃预变性25 s；95 ℃变性3 s；60 ℃退火30 s；55 ℃延伸30 s。

2 结果与分析

2.1 细胞RNA的定量分析 高质量的RNA对于获取cDNA极其重要。RNA溶液在260、280 nm下的吸光度值代表核酸和蛋白吸收值，可由此确定RNA的质量。OD260/OD280大于2.0时，说明RNA被降解成单核酸；OD260/OD280

小于1.8时，说明溶液中可能有蛋白等其他污染；OD260/OD280在1.8～2.0，说明提取出来的RNA纯度和完整度满足要求，可用于后续cDNA反转录试验。

2.2 Gen对细胞PPARα、CPT-1的mRNA表达的影响 由图1、2可知，整体上，油酸诱导组PPARα、CPT-1的mRNA表达略高于空白组。Gen试验组内，不同剂量处理组与模型组相比， PPARα 、CPT-1的mRNA表达与Gen浓度呈正相关，即随着Gen剂量的不断增加，PPARα、CPT-1的mRNA表达也随之增加，具有显著的剂量效应，说明Gen能调节PPARα、CPT-1的mRNA表达。阳性药物PPARα激动剂F组内，F对PPARα、CPT-1的mRNA表达有显著的调控作用。4种细胞中Gen、PPARα激动剂F对人正常肝细胞L-O2、小鼠3T3-L1的上调力度大于2种人肝癌细胞HepG2、Hep3b，说明正常细胞与肝癌细胞之间可能存在着代谢机制上的差异。高剂量Gen的作用效果与PPARα激动剂一致，说明Gen对CPT-1的调节是经由PPARs通路实现的，通过上调PPARα的表达，增加下游靶基因CPT-1的表达，进而加强脂肪酸β-氧化，缓解因体内游离脂肪酸过多而导致大量甘油三酯的生成和积蓄。该结论揭示了Gen在缓解和改善NAFLD发生发展中脂肪酸氧化障碍上的重要作用，为寻找治疗NAFLD的药物研究提供了新的思路。

3 结论与讨论

大豆异黄酮是大豆生长过程中产生的次级代谢产物，属于多酚类混合物，多分布于大豆子叶和胚轴中，主要的食物来源是大豆及豆制品，三羟基异黄酮在大豆中主要以糖苷的形式存在，三羟异黄酮可作为维持机体代谢动态平衡，预防和治疗与代谢综合征、癌症等相关的一些常见疾病的关键化学成分[10]。

脂肪在肝脏中的积累是由脂肪代谢异常引起的，其中脂肪酸氧化障碍导致的脂肪大量積聚，是NAFLD形成的主要原因之一。相关研究表明因过度积累的甘油三酯和高水平的游离脂肪酸等诱发的细胞毒性，导致线粒体功能发生障碍，脂肪酸氧化受阻，伴随着氧化应激、活性氧生成及内质网应激的相应机制被激活进一步加剧NAFLD形成[11]。过氧化物酶体增殖物激活受体（PPARs）属于Ⅱ型核激素受体超家族中的一员，是脂质激活的转录因子，调控机制一般是配体激活后与视黄醇类×受体（retinoid×receptor，R×R）形成异二聚体，与靶基因启动子区的过氧化物酶体增殖物反应元件（peroxisome proliferator response element，PPRE）结合，从而调控目的基因的转录[12]。PPARs被配体激活后能发挥多种生物学效应，参与调控体内的脂肪细胞分化、葡萄糖代谢、脂肪酸代谢、炎症反应等多种代谢活动，在维持机体正常生理生化过程中发挥了重要作用[13]。PPARα是PPARs核转录家族的一员，在脂肪合成、脂质代谢和胰岛素敏感等生理代谢过程中，尤其是参与脂肪酸β氧化作用的一些重要酶类表达中，PPARs发挥着关键的调控作用[14]。当前，很多研究者已经把开发PPAR配体作为治疗NAFLD的重要靶点[15]。相关试验表明非诺贝特能通过改善肝脂肪变性，上调脂肪酸β氧化基因表达调控脂质积蓄，缓解脂肪肝，虽有一定效果，但在药物毒性等方面还不尽如人意[16]。

该试验以此为切入点深入研究Gen经由PPARs信号通路对脂肪酸代谢调控的具体作用机制，结果表明Gen对脂肪酸氧化关键性转录因子PPARα、关键限速酶CPT-1的调节作用与PPARα激动剂一致，能上调PPARα、CPT-1 mRNA的表达，且随着Gen浓度的增加，上调幅度增加，呈显著的剂量依赖效应。该试验表明Gen通过PPARs信号通路，在促进脂肪酸氧化，使细胞脂肪酸含量减少，进而改善脂肪大量积聚现象，缓解和改善脂肪肝进程中发挥了重要作用。

目前對非酒精性脂肪肝的治疗，还停留在预防、单一代谢功能紊乱的针对性治疗、保守的延缓治疗以及肝移植上，研制和开发特异性的具有多重药理功效的药物及其治疗方式需要更多体内外试验的成果、需要掌握更加全面的系统化代谢机制，并将理论、科学试验和临床测试科学地结合起来，这些都有待于更深一步的摸索与研究。

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