玉米β—甘露聚糖酶基因家族的生物信息学分析

高清松 孙辉 陈国冲 韦雨亭 黄雨晴 史胜男 胥明 周建

摘要 [目的]鉴定出玉米基因组中的β-甘露聚糖酶基因（MAN），并分析其进化机制和表达模式。[方法]利用拟南芥MAN蛋白序列在玉米基因组数据库以及NCBI非冗余蛋白质数据库中比对搜索，获取玉米MAN家族全部成员；通过检索植物基因组复制数据库查找玉米MAN基因的片段复制事件；利用GSDS 2.0服务器分析基因外显子/内含子结构；采用MEGA7软件极大似然法构建系统发育树；利用芯片数据分析基因在不同组织器官中的表达模式。[结果]玉米基因组中含有6个MAN基因，分布于5条染色体上。没有玉米MAN基因起源于片段复制或串联重复事件。系统发育分析将植物MAN蛋白分为3个亚族（I～Ⅲ），说明其序列已发生分化。玉米MAN基因结构较为保守，蛋白质均含有甘露聚糖酶的核心基序。玉米MAN基因具有不同的表达模式，部分基因在发育叶片中表达量较高，部分基因在减数分裂期雄穗中表达量较高，而其余基因在胚芽鞘、初生根、授粉前果穗、花丝和发育种子中表达量较高。[结论]该研究结果为

进一步研究玉米MAN基因功能奠定了基础。

关键词 玉米；甘露聚糖酶；基因家族；进化分析；表达分析

中图分类号 S188+.1文献标识码 A文章编号 0517-6611（2018）16-0093-04

Abstract [Objective] To identify βmannanase genes （MAN） in maize and analyze their evolutionary mehanisms and expression profiles.[Method] The protein sequences of Arabidopsis MANs were used to search the Maize Genetics and Genomics and NCBI nonredundant protein databases to identify all maize MAN genes.The segmental duplication events of maize MAN genes were retrieved in the Plant Genome Duplication Database.The GSDS 2.0 server was used to analyze the exon/intron structures of genes.The phylogenetic tree was constructed using MEGA7 with a maximum likelihood method.The expression profiles of maize MAN genes were examined using microarray data.[Result] The maize genome contains six MAN genes，which are distributed on five chromosomes.No maize MAN genes were found to originate through segmental or tandem duplication events.Phylogenetic analysis divided plant MAN proteins into three subfamilies （ⅠⅢ），suggesting that their sequences have diverged.The structures of maize MAN genes are relatively conserved，and their encoding proteins all have the core motifs for mannanase activity.Maize MAN genes have distinct expression patterns； some of them have higher expressions in developing leaves，some in meiotic tassels，while others in coleoptiles，primary roots，prepollination cobs，silks and developing seeds.[Conclusion] These results lay a solid foundation for further functional analysis of maize MAN genes.

Key words Maize；Mannanase；Gene family；Evolutionary analysis；Expression analysis

植物细胞壁由纤维素、半纤维素和果胶等多糖及蛋白质组成。细胞壁降解在植物种子萌发、叶片形成、花发育、果实成熟等生长发育过程及环境应答中发挥重要作用[1]。甘露聚糖是由甘露糖通过β-1，4-糖苷键连接而成的线状多糖。如果主链中的部分甘露糖残基被葡萄糖取代，或者甘露糖残基上连有半乳糖，则形成异甘露聚糖，包括葡甘露聚糖、半乳甘露聚糖和半乳葡甘露聚糖[2]。甘露聚糖和异甘露聚糖是构成植物半纤维素的第二大组分[3-4]。这些物质的分解主要依靠β-甘露聚糖酶（Endo-β-Mannanase，MAN）完成。MAN在细菌、真菌和植物中均能合成。根据糖类活性酶数据库（CAZY）的分类，MAN属于糖基水解酶超家族中的家族5和26，而在植物中合成的MAN均属于家族5[5]。由于MAN具有较高的工业、食品以及医药方面的应用价值，且其在微生物中來源丰富、活性高、提取方便，因此研究多集中在酶的微生物生产以及基因工程改造等方面[6]，而在植物中的报道相对较少。

植物中首个MAN基因LeMAN1是从番茄种子中分离出来的，主要在萌发后种子的胚乳中表达，可能通过分解胚乳细胞壁中半乳甘露聚糖为幼苗生长提供营养[7]。随后，在番茄中又分离出4个MAN基因LeMAN2、LeMAN3、LeMAN4和LeMAN5[8-9]。其中，LeMAN2和3也主要在萌发种子中表达；LeMAN4主要在番茄果实中表达，参与果实的成熟；LeMAN5主要在花药和花粉中表达，参与花药和花粉的发育[9-10]。拟南芥和水稻基因组中分别含有8个和9个MAN基因，分别命名为AtMAN1～AtMAN7和AtMANP以及OsMAN1～OsMAN8和OsMANP[11]。其中，拟南芥AtMAN3和4主要在角果中表达，AtMAN2、5、6和7在根、茎、叶、角果和种子中均有表达，AtMAN1在各组织器官中表达量很低，而AtMANP被证实为假基因[12]。AtMAN5、6和7基因的敲除突变体种子萌发速度显著变缓[12]。水稻OsMAN1、2、4、6和8基因在根、茎、叶片和种子中均有表达，OsMAN3和OsMANP特异地在种子中表达，而OsMAN5和7在各组织器官中均未检测到表达[11]。此外，杨树基因组含有8个MAN基因[11]。其中，PtMAN4、6和8在分化的木质部组织中特异表达，PtMAN5在木质部、韧皮部和叶片中均有表达，PtMAN7主要在幼叶和叶尖中表达，而其他基因在上述组织中未检测到表达[13]。过表达PtMAN6导致杨树细胞壁松弛，并抑制木质部次生细胞壁增厚，而下调其表达则促进次生细胞壁增厚[13]。进一步分析发现，PtMAN6降解作用产生的寡糖作为重要的信号分子发挥作用。

玉米是我国第一大粮食作物。虽然MAN基因在番茄、水稻、拟南芥、杨树等植物中已有报道，但在重要作物玉米中的成员及其功能还不清楚。笔者采用生物信息学方法对玉米基因组中的MAN基因进行系统鉴定，并对其进化机制和表达模式进行分析，旨在为玉米MAN基因的功能研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 玉米MAN基因的鉴定

以擬南芥中8个MAN蛋白的氨基酸序列作为查询序列，在玉米遗传学和基因组学数据库（MaizeGDB，https：//www.maizegdb.org/）以及NCBI非冗余蛋白质数据库中进行BlastP比对搜索，获取候选序列，阈值设定为E≤10-10。将候选序列输入Pfam数据库（http：//pfam.xfam.org/）验证是否存在糖基水解酶家族5结构域（获取号：PF00150），如果存在，则认为属于MAN家族。去除不完整序列和冗余序列，下载其余序列的座位号、基因组位置等信息。利用ProtParam工具（https：//web.expasy.org/protparam/）计算蛋白质等电点和分子量，利用TargetP（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）进行蛋白质亚细胞定位预测。

1.2 染色体分布、基因复制和基因结构分析

利用MapChart软件绘制染色体分布图。通过检索植物基因组复制数据库（PGDD，http：//chibba.agtec.uga.edu/duplication/index/locus）查找玉米MAN基因的片段复制事件。利用GSDS 2.0服务器（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）分析玉米MAN基因的外显子/内含子结构。

1.3 蛋白质系统发育和保守序列分析

利用ClustalW工具进行蛋白质多序列比对，采用MEGA7软件极大似然法基于JTT模型构建系统发育树[14]，gap处理设置为partial deletion，位点覆盖阈值设定为95%。Bootstrap重抽样进行了100次。利用MEME程序（http：//memesuite.org/tools/meme）预测玉米MAN蛋白的保守基序，采用InterProScan工具（http：//www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequencesearch）对基序序列做进一步注释。

1.4 基因表达分析

从植物表达数据库（PLEXDB，http：//www.plexdb.org/）下载利用Nimblegen玉米全基因组芯片平台生产的玉米B73全生育期基因表达数据，从中检索玉米MAN基因的表达值，利用Cluster 3.0软件完全连锁法对平均表达值进行层级聚类，绘制基因表达热图。

2 结果与分析

2.1 玉米MAN基因的鉴定

利用拟南芥MAN蛋白序列在MaizeGDB和NCBI非冗余蛋白质数据库中比对搜索，共鉴定出玉米基因组中6个MAN基因。根据基因在染色体上的位置系统命名为ZmMAN1～ZmMAN6（表1）。所有玉米MAN基因均有EST记录支持，表明它们均是表达的基因。玉米MAN蛋白的长度为314～470 aa，等电点为5.4～10.8，蛋白质分子量为35 291.3～52 465.3 Da（表1）。蛋白质亚细胞定位预测表明，多数玉米MAN蛋白为分泌蛋白，与其他植物MAN蛋白的定位一致[11，13]。

2.2 玉米MAN基因的染色体分布和蛋白质系统发育分析

玉米MAN基因分布于5条染色体上，其中3号染色体含有2个基因，其余染色体均含有1个基因（图1）。基因复制分析表明，没有基因起源于片段复制事件。此外，玉米MAN基因在染色体上相距较远，也不是起源于串联重复事件。转录方向分析表明，有2个基因（ZmMAN2和3）为反向转录，其余基因均为正向转录（图1）。

为研究植物MAN蛋白的进化历史与机制，对番茄、拟南芥、杨树、水稻和玉米MAN蛋白共36条序列构建系统发育树。结果表明，植物MAN蛋白可以分为3个亚族（Ⅰ～Ⅲ，图2），说明该家族蛋白的序列和功能可能已经发生分化；每个亚族均含有单、双子叶植物序列，说明该家族的基本特征在单、双子叶植物分化之前就已经建立。在系统发育树的末端各发现了2对番茄、拟南芥、杨树和水稻旁系同源基因，说明该家族在这些物种中以物种特异的方式进行了扩张。玉米MAN蛋白在3个亚族中均有分布，但未发现旁系同源基因。所有番茄MAN蛋白均位于亚族I中。

2.3 玉米MAN基因结构和蛋白质保守序列分析

通过将玉米MAN基因的cDNA序列与基因组序列比较确定基因的外显子/内含子结构。除ZmMAN3和4基因含有4个外显子之外，其余基因均含有5个外显子（图3）。ZmMAN6含有较大的内含子。内含子相位分析表明，亚族Ⅱ基因具有相同的内含子相位，而其余亚族基因的内含子相位均不保守。

蛋白质保守序列分析共鉴定出玉米MAN蛋白中8个保守的基序（图4）。其中，ZmMAN4不含基序6和8，ZmMAN5不含基序6，ZmMAN6不含基序8，其余蛋白均含有8个基序。通过在InterPro数据库中检索，对基序序列做进一步分析。结果表明，基序1、2、4、5和7为甘露聚糖酶活性的核心基序；基序3属于未命名蛋白家族（获取号：PTHR31451）；基序6和8为糖基水解酶家族的共有基序。

2.4 玉米MAN基因表达模式分析

为研究玉米MAN基因的功能，利用芯片数据详细分析了基因在20个组织中的表达模式，结果表明，玉米MAN基因的表达已经发生了显著的分化（图5）。其中，ZmMAN1在发育叶片中的表达量较高，而在茎秆和授粉24 d后胚乳中表达量较低；ZmMAN4和5在减数分裂期雄穗中表达量较高；ZmMAN2在胚芽鞘、初生根、授粉前果穗和授粉4 d后的种子中表达量较高，而在萌发种子、发育中的叶片、花药和授粉24 d后的胚乳中表达量较低；ZmMAN3在幼叶、花丝、授粉4 d和12 d后的种子中表达量较高；ZmMAN6在9叶期叶片、授粉前果穗、花丝和授粉4 d后种子中表达量较高，而在萌发种子和授粉24 d后胚乳中表达量较低。值得注意的是，基于基因表达模式的聚类结果与系统发育树的亚族划分并不一致，说明氨基酸序列的相似性不能完全反映基因表达模式的相似。

3 结论与讨论

甘露聚糖是组成植物细胞壁的重要半纤维素多糖。MAN通过水解甘露聚糖使细胞壁松弛，在植物分生组织生长、果实成熟、程序性细胞死亡以及种子萌发等过程中發挥重要功能[5]。该研究采用生物信息学方法鉴定出玉米基因组中6个MAN基因，分布于5条染色体上。这些基因的外显子/内含子结构相对保守，并且编码蛋白都含有甘露聚糖酶的核心基序，但基因的表达模式已经发生了显著的分化。这些结果为玉米MAN基因的进一步功能研究奠定了基础。

基因复制是植物基因家族进化的重要动力。基因复制可以通过片段复制、串联重复和逆转录转座等方式产生[15]。玉米基因组中含有6个MAN基因。基因复制分析表明，没有玉米MAN基因起源于片段复制或串联重复事件，这可能是复制后基因丢失的结果。另一方面，由于玉米基因组的注释还不够完善，可能部分基因未被注释出来。近来研究表明，禾本科植物二穗短柄草基因组也含有6个MAN基因，并且没有基因起源于复制事件[16]。

拟南芥、水稻和杨树MAN基因的外显子/内含子结构分析表明，多数基因含有5个外显子，说明该结构是植物MAN基因的典型结构，可能来自于共同的祖先基因[11]。此外，虽然植物MAN基因的内含子位置相对保守，但同一内含子的大小在不同基因之间变化较大。该研究中多数玉米MAN基因含有5个外显子，且外显子大小相对保守，但部分基因的内含子大小变异较大（图3），与其他植物中的研究一致。蛋白质保守基序分析表明，玉米MAN蛋白均含有甘露聚糖酶催化的核心基序，表明它们可能都是有活性的甘露聚糖酶。

甘露聚糖存在于植物的各种组织中，如在拟南芥中整株都有分布，但在花、角果和茎秆中含量更为丰富[17]。其在植物细胞壁中的功能一方面通过与纤维素结合发挥支撑作用，另一方面在胚乳细胞壁以及种子和营养组织的液泡中作为非淀粉碳水化合物储藏[2]。MAN是催化甘露聚糖骨架水解的关键酶[3]。基因表达模式分析表明，水稻、拟南芥和杨树MAN基因的表达已经发生了显著的分化。部分基因在各组织器官中呈组成型表达，部分基因在角果、种子或木材木质部中特异表达。这些结果表明，植物MAN基因可能在不同的生物过程中发挥功能[11]。该研究中玉米MAN基因的表达也已发生分化，部分基因在发育叶片中表达量较高，部分基因在减数分裂期雄穗中表达量较高，而另外一些基因在胚芽鞘、初生根、授粉前果穗、花丝和发育种子中表达量较高，说明玉米MAN基因可能在不同组织细胞壁甘露聚糖的降解中发挥作用。此外，系统发育分析将植物MAN蛋白分为3个不同的亚族，说明其序列已经发生分化，推测不同亚族的蛋白可能分解不同类型的甘露聚糖。进一步通过突变体和过表达分析将有助于阐明玉米MAN基因的生理功能。

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