聚己内酯肝素涂层的制备与结构分析

唐家钦 周贤轩

摘要 [目的]分析聚己内酯肝素涂层的制备与结构。[方法]采用终点固定法在PCL表面制备肝素涂层，以共价键的形式把肝素分子还原端醛基连接到氨基修饰聚己内酯表面，充分暴露肝素分子的活性基团。[结果]制备的聚己内酯肝素涂层密度为4.8 μg/cm2，与已报道的肝素涂层相比较，肝素密度提高了1.3～2.4倍。傅里叶红外光谱检测表明，该材料增加了N-H振动峰和C-N振动峰。进一步用X射线光电子能谱分析（XPS）发现在具备肝素涂层的PCL表面增加了N、S、Na等元素信号。[结论]肝素还原端已经通过碳氮键与聚己内酯形成了共价结合，并且肝素涂层含量显著提高，这将有利于对该材料功能的进一步研究。

关键词 聚己内酯；肝素涂层；制备；结构

中图分类号 Q939.9 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2018）21-0175-03

Abstract [Objective]The research aimed to analyze the preparation and structure of heparin coating on polycaprolactone.[Method]A heparin coating was prepared on the surface of the PCL using an endpoint fixation method， and the heparin molecule reducing aldehyde group was attached to the aminomodified polycaprolactone surface in a covalent bond form to fully expose the active group of the heparin molecule.[Result]The prepared polycaprolactone heparin coating had a density of 4.8 μg/cm2， and the heparin density increased by 1.3-2.4 times compared with the heparin coating reported.Fourier infrared spectroscopy showed that the material increased the NH vibration peak and the CN vibration peak.Further Xray photoelectron spectroscopy （XPS） analysis revealed that N， S， Na and other elements were added to the surface of PCL coated with heparin.[Conclusion]The heparin reducing end has formed a covalent bond with polycaprolactone through a carbonnitrogen bond， and the heparin coating content is significantly increased， which will facilitate the further study of the function of the material.

Key words Polycaprolactone；Heparin coating；Preparation；Structure

聚己内酯（polycaprolactone，PCL）是一种半结晶型脂肪族聚酯材料，因其无毒性、可生物降解性和良好的渗药性，在农牧业重要经济动物的医疗中有潜在的应用前景[1-3]。 这些生物可降解材料适于做植入性骨折固定材料、外科手术缝合线等，可避免二次手术造成的不必要的损伤。PCL是通过ε-己内酯单体在金属阴离子络合催化剂催化下开环聚合而成的高分子有机聚合物，结构如图1a所示[4]。

通常认为在PCL等非生物材料表面制备肝素化涂层有利于阻止血细胞在材料表面聚积形成血液凝块，增强材料的生物相容性。肝素是一种临床广泛使用的抗凝血药物，它由动物细胞合成并分布于各種细胞表面，可以募集多种细胞因子，具有多种生物学功能如抗凝血、抗炎、抑制平滑肌细胞增殖、促进细胞黏附等[5]。肝素结构如图1b所示，由艾杜糖醛酸和葡萄糖胺以1-4糖苷键连接的重复二糖单元组成，一般含有10～30个二糖单元，平均分子量为14 000 u。

目前的方法制备的肝素涂层存在易脱落及肝素含量偏低等缺陷。医用非生物材料表面的肝素涂层制备有3个主要考量因素：肝素分子的稳定性、肝素在生物材料表面的固定效率以及固定化肝素在生物材料表面能否保持足够的生物学活性。据报道，肝素涂层制备方法有物理固定法、离子结合法、共价结合法等[6-7]。其中通过物理固定法和离子结合法制备的肝素涂层主要通过离子键及其他次级键与非生物材料相结合，易受到不同酸碱度及盐离子浓度等环境条件影响，涂层不稳定，难以保持肝素分子的生物学活性。已报道的共价结合法中，通常让肝素分子多个活性基团与材料偶联，使得其生物学活性损失较多，而且涂层的肝素分子密度也不够大[8]。笔者采用终点固定法在PCL表面制备肝素涂层，有利于对该材料功能的进一步研究。

1 材料与方法

1.1 材料

聚己内酯、肝素钠、硫酸、氢氧化钠购于国药集团化学试剂有限公司；透析袋（10 kDa MWCO）、苯甲基磺酰氟、咪唑、Bradford法蛋白浓度测定试剂盒购于生工生物工程（上海）股份有限公司；亚硝酸钠、乙二胺、甲醇、氰基硼氢化钠、甲苯胺蓝购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；大肠杆菌表达菌株BL21/pHEPⅡ、BL21/pHEPⅢ由合肥工业大学微生物与酶工程实验室保存。

1.2 方法

1.2.1

肝素水解酶HEP Ⅱ与HEP Ⅲ的表达与纯化。

分别挑取肝素水解酶表达菌株BL21/pHEP Ⅱ、BL21/pHEP Ⅲ单克隆37 ℃过夜活化。菌液按1%（体积比）分别接种至1 L LB培养基中，37 ℃振荡培养2 h至OD600值为0.6左右。加入诱导剂异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）至终浓度为0.2 mmol/L，22 ℃振荡培养过夜。

过夜培养的菌液5 000 g離心20 min，收集菌体。用30 mL Solution I（Tris-HCl 20 mmol/L、pH 7.6、NaCl 200 mmol/L）重悬菌体，加入苯甲基磺酰氟（PMSF），用超声波破碎细胞（工作时间5 s，暂停时间5 s，功率50%，总时间30 min）。将细胞破碎液12 000 r/min 4 ℃ 离心20 min，收集上清。用Solution Ⅰ 充分平衡Ni亲和层析柱，粗蛋白溶液上样后，用Solution II（20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.6，200 mmol/L NaCl，50 mmol/L咪唑）洗脱杂蛋白，用Solution Ⅲ（20 mmol/L Tris-HCl、pH 7.6、200 mmol/L NaCl、250 mmol/L咪唑）洗脱目的蛋白。10 kDa的透析袋充分透析后用Bradford法蛋白浓度测定试剂盒对蛋白质浓度进行定量。

1.2.2 聚己内酯肝素涂层的制备。

为了把肝素分子固定在聚己内酯材料表面，首先需要活化肝素并制备氨基化聚己内酯（PCL-NH2），使肝素分子末端生成的醛基与聚己内酯表面的氨基通过脱水反应，形成共价键而偶联在一起。在100 mL 3.9 mol/L的亚硝酸溶液（pH 4.0）中加入25 mL 25 mg/mL肝素溶液，室温下反应20 min。用1 mol/L NaOH调节pH至8.0后在去离子水中充分透析。然后将醛基化肝素样品冷冻干燥， PBS溶解定容至20 mg/mL保存备用。

将PCL材料置于1 mol/L NaOH中50 ℃水浴24 h，用去离子水漂洗，室温干燥后放入培养皿中，加入10 mL 40%乙二胺，室温浸泡2 h。吸去乙二胺，用PBS洗涤，室温干燥过夜，即得到PCL-NH2。把PCL-NH2放入20 mg/mL醛基化肝素与100 mmol/L NaBH3CN等体积混合液中，室温静置2 h。吸去培养皿中液体，用PBS充分洗涤并室温干燥，即得到肝素涂层修饰的聚己内酯材料（PCL-HEP）。

1.2.3 PCL-HEP肝素含量测定。

Smith等[9]提出了甲苯胺蓝法测定肝素含量的方法。该研究在Smith等方法的基础上加以改进，染色后的PCL-HEP经PBS洗涤后用肝素酶裂解，测量裂解液中的甲苯胺蓝含量。改进后的方法去除材料表面结合不牢固的甲苯胺蓝，结果更加准确、直观。

首先绘制一组标准曲线，取6支试管，分别加入40、50、60、70、80、90 μL的0.0166%肝素溶液，补加0.2%NaCl至100 μL，再加入100 μL 0.005%甲苯胺蓝溶液。旋涡振荡30 s，每管加入1 mL正己烷，剧烈振荡30 s，1 000 r/min离心3 min。弃去有机相，用分光光度计测水相OD630。以肝素含量为横坐标、OD630值为纵坐标，绘制标准曲线，根据标准曲线计算出每OD对应的肝素含量。取一粒PCL-HEP放入一个干净的1.5 mL离心管中，加入100 μL 0.2% NaCl溶液和100 μL 0.005%甲苯胺蓝溶液，混匀，室温静置，染色过夜。PCL作对照，每组做3个平行。吸去染色液，加入1 mL PBS漂洗，重复洗涤3遍。加入200 μL 0.05 mg/mL HEP Ⅱ、0.05 mg/mL HEP Ⅲ混合溶液，37 ℃反应4 h，测酶解液的OD630，根据甲苯胺蓝标准曲线计算得出固定化肝素的含量。

1.2.4 XPS分析。

X射线光电子能谱（X-ray photoelectron spectroscopy， XPS）技术作为研究物体表面组成和结构的常用能谱分析技术，具有无破坏性、表面灵敏等特点，被广泛应用于表面分析。为了验证肝素成功地固定在聚己内酯表面，检测PCL-HEP和PCL的表面元素组成，对样品做X射线光电子能谱扫描。将PCL-HEP样品（或PCL样品）放入一个干净的1.5 mL 离心管中，使用X射线光电子能谱仪检测，所用阳极靶为Al靶，功率300 W。首先测试样品的0～1 400 eV 的全扫描谱得到总谱图，获得表面元素种类的信息，而后对样品的N1s和S2p轨道进行窄谱扫描，数据用Thermo Avantage软件处理。

1.2.5 傅里叶红外光谱检测。

傅里叶红外光谱（FTIR）能够从分子水平反映物质的化学结构，被广泛应用于材料、生物、化工等领域。为了检测肝素化修饰前后聚己内酯结构的变化，确认肝素成功地固定在聚己内酯表面，将PCL-HEP样品（或PCL样品）放入一个干净的1.5 mL 离心管中，使用Nicolet 67傅里叶红外光谱仪检测，扫描波数范围为500～4 000 cm-1，数据用Omnic 8.2软件处理。

2 结果与分析

2.1 聚己内酯肝素涂层的制备与定量

为了把肝素固定在聚己内酯表面，首先在PCL表面引入氨基，同时制备醛基化肝素，然后利用氨基和醛基之间的席夫碱反应，以共价键的形式把肝素分子还原端醛基连接到氨基修饰的PCL表面，从而得到具有肝素涂层的PCL材料。PCL-HEP的肝素涂层可用甲苯胺蓝溶液染色检测，结果如图2所示。

根据甲苯胺蓝染色分析结果显示，聚己内酯材料PCL-HEP的肝素涂层密度为4.8 μg/cm2，与对照组差异显著。PCL-HEP的肝素涂层可与甲苯胺蓝结合而显色，而对照组PCL不能被甲苯胺蓝染色。据报道，在聚氨酯表面制备的肝素涂层密度为1.4～3.6 μg/cm2 [8]，该研究中聚己内酯肝素涂层密度与之相比提高了1.3～2.4倍， 可能是因为用于偶联的活性基团较小，空间位阻效应较小，使得更多的肝素分子可以通过共价键与聚己内酯材料相连接。

2.2 PCL-HEP的傅里葉红外光谱分析

PCL-HEP肝素涂层的结构使用傅里叶红外光谱仪进行了分析，扫描范围为500～4 000 cm-1。从PCL和PCL-HEP的红外扫描波形（图2）可看出，相对于PCL，PCL-HEP在3 300～3 480 cm-1处显示了N-H和C-N的振动峰，在1 570 cm-1处显示了N-H特征峰。PCL分子中没有N-H键和C-N键，而PCL-HEP肝素涂层通过乙二胺偶联到了PCL上，含有丰富的N-H和C-N键。

2.3 PCL-HEP肝素涂层的XPS分析

为了进一步检测PCL-HEP肝素涂层的元素组成，对PCL-HEP和PCL进行XPS全扫描，用Thermo Avantage软件处理分析结果。PCL-HEP的扫描分析结果如图3a所示，PCL的扫描分析结果如图3b所示。在PCL-HEP 的XPS全谱扫描谱图上，出现了Na1s、O1s、N1s、C1s等元素信号，而PCL只出现了O1s、C1s等元素信号。PCL只含有O元素和C元素， N元素是乙二胺分子和肝素分子的组成元素，Na元素是肝素钠的组成元素。S元素是肝素分子的特征元素，但在PCL-HEP的XPS全谱扫描谱图上，S2p信号不明显，可能与肝素总量较少有关。

为了进一步分析PCL-HEP样品表面元素组成，对N元素和S元素进行了窄波扫描。N元素窄波扫描结果用Thermo Avantage软件进行拟合，其分析如图4所示。PCL-HEP和PCL的N元素扫描结果与预期一致，PCL本身不含有N元素，N元素窄波扫描没有信号峰；而PCL-HEP样品中乙二胺分子和肝素分子都含有N元素，N元素窄波扫描出现了N元素的强信号峰。同样地，S元素窄波扫描结果用Thermo Avantage软件处理，对信号峰进行拟合，结果如图5所示。S元素窄波扫描结果显示了PCL-HEP的S2p信号，而PCL分析结果没有显示S元素信号。这些分析结果清楚表明PCL-HEP表面存在共价偶联的肝素涂层。

3 结论

在该研究中，聚己内酯材料经过乙二胺处理在表面引入了活性氨基层，同时用亚硝酸部分降解的方法制备了醛基化肝素。利用醛基化肝素与氨基发生席夫碱反应，以共价键的形式把肝素分子还原端醛基连接到氨基修饰聚己内酯表面，充分暴露了肝素分子的活性基团，并且稳定的共价键连接使肝素涂层的稳定性及含量都得到了显著提高。PCL-HEP中肝素含量为4.8 μg/cm2，与已报道的肝素涂层相比较[8]，肝素密度提高了1.3～2.4倍。 PCL-HEP肝素涂层进一步通过X射线光电子能谱技术和傅里叶红外光谱技术进行了分析，显示了PCL-HEP增加了N、S和Na元素，以及增加了C-N键和N-H键。

该研究还改进了甲苯胺蓝染色法。用大肠杆菌表达2种肝素水解酶HEP Ⅱ 和HEPⅢ，利用纯化的肝素水解酶把结合于肝素分子的甲苯胺蓝分子释放出来，用于对PCL-HEP样品中肝素含量的测定。改进后的甲苯胺蓝染色测定肝素多糖方法更加直接、准确。

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