一种富硒蛇莓的培育方法

苟体忠　贺仲兵　潘甚锡

摘要 [目的]探讨一种富硒蛇莓的培育方法。[方法]采用亚硒酸钠浓度0、2、4、8、16、32、64、128、256、512 ng/mL的水溶液对蛇莓叶喷施，考察喷施亚硒酸钠后有机硒在蛇莓中的变化规律。[结果]叶面喷施硒能显著提高蛇莓中的有机硒含量。蛇莓中有机硒的含量随喷施亚硒酸钠浓度的提高而增加，当喷施亚硒酸钠浓度达到256 ng/mL时，蛇莓中的有机硒含量达到最大值，其值为20.94 μg/g。[结论]蛇莓叶面喷施亚硒酸钠溶液的最佳浓度为256 ng/mL，且采用低浓度的亚硒酸钠溶液对蛇莓进行多次喷硒的方法有利于蛇莓对无机硒的吸收和转化。

关键词 蛇莓；亚硒酸钠；叶面喷施；硒

中图分类号 S567.23 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2018）17-0065-03

Abstract [Objective] To research a method of cultivating richselenium Duchesnea indica （Andr.） Focke. [Method]Sodium selenite was sprayed on the leaves of D. indica，the concentrations of which were 0， 2， 4， 8， 16， 32， 64， 128， 256， 512 ng/mL， respectively. The change law of organic selenium in D. indica after spraying sodium selenite was investigated. [Result] With the rise of spraying sodium selenite concentration， the content of organic selenium was significantly improved.When spraying sodium selenite concentration reached 256 ng/mL， the content of organic selenium in D. indica reached the maximum， which was 20.94 μg/g. [Conclusion] The optimum concentration of sodium selenite spraying on leaves of D. indica was 256 ng/mL. And the low concentration of inorganic selenium spraying on D. indica repeatedly was benefical for its absorption and transformtion.

Key words Duchesnea indica （Andr.） Focke；Na2SeO3；Forliar spraying；Selenium

蛇莓为蔷薇科植物蛇莓（Duchesnea indica（Andr.）Focke）的全草，又名龙吐珠。性甘、苦、寒，有小毒。具有凉血消肿，清热解毒，化痰止咳的功效。动物实验研究表明，蛇莓具有抗癌细胞突变作用，其抗癌效果较强。目前，蛇莓与其他中草药配伍可以治疗食管癌、胃癌、肝癌、直肠癌、鼻咽癌、甲状腺癌、胸腺癌、皮肤癌等多种癌症[1]。

硒不但是人体必需的微量元素之一，而且也是“抗癌之王”[2]。若抗癌中草药中的有效成分与硒形成植物有机硒，该有机硒可能具有功效更加独特的疗效。因此，从富硒抗癌中草药中提取有机硒并对其进行抗癌活性研究，将会成为寻找抗癌新药的有效途径之一。目前，虽然有学者从天然植物中提取出了部分有机硒化合物，如：甲基硒半光氨酸（MeSeCys，NH2-CH（CO2H）-CH2-Se-CH3）[3]、γ-谷胺酰-甲基硒代半光氨酸（γ-glutamyl-MeSeCys，NH2-CH（CO2H）-（CH2）2-CO-NH-CH（CO2H）-CH2-Se-CH3）[4]、硒代蛋氨酸（Se-Met，NH2-CH（CO2H）-CH2-CH2-Se-CH3）[5]、硒代半光氨酸（Se-Cys，NH2-CH（CO2H）-CH2-SeH）[5]、丙基硒代半胱氨酸（ProSeCys，NH2-CH（CO2H）-CH2-Se-CH2-CH2-CH3）[5]、硒代光氨酸（Se-Cys2，NH2-CH（CO2H）-CH2-Se-CH2-CH（CO2H）NH2）[6]，其中甲基硒半光氨酸（MeSeCys，NH2-CH（CO2H）-CH2-Se-CH3）[3]、γ-谷胺酰-甲基硒代半光氨酸（γ-glutamyl-MeSeCys，NH2-CH（CO2H）-（CH2）2-CO-NH-CH（CO2H）-CH2-Se-CH3）[4]已被证实具有较强的抗癌活性。但天然植物中有机硒的含量是有限的，很多有机硒化合物由于含量低而不能被检测，因此从药用植物中寻找抗癌有机硒化合物受到了限制。有学者研究表明，叶面喷硒能显著提高植物体内有机硒的含量[7-9]。鉴于此，笔者以具有抗癌活性的蛇莓作为研究对象，采用叶面喷施亚硒酸钠的方法，探讨叶面喷施亚硒酸钠对蛇莓有机硒含量的影响，并筛选出富硒蛇莓的最佳亚硒酸钠浓度，以便为下一步采用制备液相色谱法从富硒蛇莓中分离含硒有机物，以及将该有机硒化合物用于医学研究奠定基礎。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验于2013年6—12月在凯里学院富硒中草药研究中心的温室内进行。供试土壤为黄壤，为了增加土壤的肥力和透气性，将黄壤、兔子粪和细木碎屑按2.0∶1.0∶0.5拌匀，并将等量的上述土壤装入30个大盆（直径30 cm，高度20 cm）中待用。供试蛇莓种子和亚硒酸钠分别由沭阳县佳康园林绿化苗木场和上海晶纯生化科技股份有限公司提供。

1.2 试验方法

试验处理共9个，每个处理3个重复，以不喷硒为空白（CK）。自蛇莓幼苗长出5～6片叶时，对其叶片的正反面进行均匀喷硒。10个处理（CK，T1～T9）对应的亚硒酸钠溶液浓度分别为0、2、4、8、16、32、64、128、256、512 ng/mL，每次喷施亚硒酸钠溶液100 mL，间隔时间为10 d，共喷硒10次。

1.3 项目测定

1.3.1 样品的前处理。

喷硒结束后的第10天采摘蛇莓样品，先将其装满自来水的大桶中漂洗5次，再用蒸馏水漂洗3次，然后将其自然晾干并放入70 ℃烘箱中干燥至恒重。干燥后的蛇莓样品用小型粉碎机（HK-02A，旭朗机械成都分公司）粉碎并过200目筛，储存于自封袋中待用。

1.3.2 硒标准曲线的建立。

硒标准储备液的配置（1 000 ng/mL）：准确量取1 mL 硒标准溶液（BW079812，标准值：100 μg/g）于100 mL容量瓶中，用超纯水定容至刻度，摇匀待用。

硒标准系列溶液的配置：准确量取0、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2 mL的硒标准储备液于6个100 mL的容量瓶中，加入25 mL 浓盐酸，用超纯水定容至刻度，即得0、2、4、8、16、32 ng/mL的硒标准系列溶液，摇匀待测。

1.3.3 总硒的提取。

蛇莓中总硒的提取在凯里学院化学与材料工程学院原子荧光分析室完成，并采用苟体忠等[10]建立的分析方法测定蛇莓样品中的总硒。其简要分析流程为：称取约0.500 0 g样品于150 mL锥形瓶中，加入15 mL 混酸（VHNO3∶VHClO4=2∶1），冷消化过夜，并于电热板上加热样品溶液至1 mL，加入5 mL浓盐酸，再加热样品溶液至1 mL，取下冷却，用超纯水将样品溶液转移至50 mL容量瓶中，并加入12.5 mL浓盐酸，最后用超纯水定容至刻度，摇匀待测。

1.3.4 无机硒的提取。

采用催海容等[11]建立的方法提取蛇莓中的无机硒。其简要流程为：准确称取1.000 0 g蛇莓样品，置于50 mL离心管中，分2次加入25 mL超纯水，超声提取30 min，5 000 r/min条件下离心10 min，2次提取的上清液合并，再用等量的环己烷萃取1次，弃去有机相，水相转入150 mL锥形瓶中，然后按“1.3.3”操作。

1.3.5 硒含量的测定。

样品中的硒含量采用顺序注射双道原子荧光光度计（AFS-230E，北京海光仪器有限公司）进行测定。

1.3.6 总硒/无机硒含量的计算。

总硒/无机硒含量（ng/g）=溶液浓度（ng/mL）×溶液总体积（mL）/取样量（g）。

1.3.7 有机硒含量的计算。

有机硒含量=总硒含量-无机硒含量。

1.4 数据处理

采用SPSS 17.0和Origin 8.0软件进行数据处理。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的绘制

采用氢化物发生原子荧光谱法测定“1.3.2”中硒标准系列溶液的荧光强度，以硒标准溶液浓度（C）为横坐标，以硒荧光强度（IF）为纵坐标作图（图1），得到标准曲线的线性回归方程为IF=56.54C+3.47，回归系数r=1.000 0，表明硒浓度在0～32 ng/mL范围内呈良好的线性关系。

2.2 叶面喷硒对蛇莓总硒的影响

从表1可以看出，对蛇莓进行叶面喷硒后其总硒含量从0.45 μg/g增加到35.12 μg/g，其最大值是CK的78.04倍。差异分析表明，其相邻2个处理间总硒的含量均呈显著性差异（见表1）。分析认为，叶面喷硒对蛇莓总硒含量的影响较大。

2.3 叶面喷硒对蛇莓无机硒的影响

由表1可知，采用叶面喷硒后，蛇莓中的无机硒含量变化较大，无机硒含量从0.15 μg/g增加到18.49 μg/g，其最大值是CK值的126.06倍。差异分析表明，处理T1～T4 随着喷硒浓度的增加不存在显著性差异，但处理T5～T9存在显著性差异。分析认为，当叶面喷硒浓度小于16 ng/mL时，蛇莓中无机硒的含量受叶面喷硒的影响不大，然而当叶面喷硒浓度大于32 ng/mL时，蛇莓中无机硒的含量受叶面喷硒的影响较大。

2.4 叶面喷硒对蛇莓有机硒的影响

随着叶面喷施亚硒酸钠浓度的增加，有机硒含量逐渐增加，其值从0.30 μg/g逐渐增加到20.94 μg/g，当蛇莓叶面喷硒浓度达到256 ng/mL时，蛇莓中有机硒的含量达到最大值，而当喷硒浓度大于256 ng/mL时，蛇莓中有机硒的含量显著降低（见表1）。差异分析表明，除了处理T1和T2之间不存在显著性差异外，其他相邻处理间均存在显著性差异。分析认为，采用叶面喷适当浓度的亚硒酸钠溶液能明显增加蛇莓中的有机硒含量，喷施亚硒酸钠溶液的浓度太高会降低蛇莓中的有机硒的含量。

2.5 叶面喷硒对蛇莓有机硒转化率的影响

从表1可知，有机硒的转化率从处理T1～T4逐渐增加，当叶面喷施亚硒酸钠浓度16 ng/mL，蛇莓中有机硒的转化率达到90.5%。但从处理T5～T9逐渐降低，当叶面喷施亚硒酸钠浓度为512 ng/mL时，蛇莓中有机硒的转化率降低到47.3%，该处理有机硒的转化率远低于CK值。分析认为，喷施亚硒酸钠浓度16 ng/mL时最有利于将蛇莓中的无机硒转化为有机硒。从表1的分析结果可知，虽然此处理有机硒的转化率最高，但蛇莓中的有机硒含量尚未达到最大值。同时分析结果还表明，当叶面喷施亚硒酸鈉浓度大于16 ng/mL时，蛇莓中有机硒的转化率虽然有所降低，但是对比CK可以看出处理T6～T8的蛇莓有机硒的转化率均高于CK。结果表明，叶面喷施亚硒酸钠浓度小于或等于256 ng/mL时，蛇莓并没有表现出硒中毒，但当叶面喷施亚硒酸钠浓度大于该浓度时，蛇莓表现出硒中毒，且有机硒的转化率迅速降低。上述分析表明，蛇莓叶面喷施亚硒酸钠的最佳浓度为256 ng/mL，并以此亚硒酸钠浓度对蛇莓进行喷施，可以获得含20.94 μg/g有机硒的富硒蛇莓。

3 讨论

前人研究表明，植物叶面喷硒能显著提升植物体内的硒含量[12-14]。该试验分析结果表明，叶面喷施亚硒酸钠溶液显著提升了蛇莓中的有机硒的含量，当喷施亚硒酸钠溶液浓度为256 ng/mL时，蛇莓中有机硒的浓度达到最大值（20.94 μg/g），是CK的69.8倍。紫云英是目前公认的硒集聚植物[15]，张祥明等[13]以360 μg/mL的亚硒酸钠溶液对紫云英进行了3次喷施，并获得了最大硒含量（总硒含量为13.54 μg/g）的富硒紫云英，为CK的148.79倍。然而，该试验采用256 ng/mL亚硒酸钠溶液对蛇莓进行10次喷施，获得有机硒的含量为20.94 μg/g，高于上述紫云英中硒的最大值。分析认为，采用低浓度的亚硒酸钠溶液对植物进行多次喷施的方法有利于植物对无机硒的吸收和转化。

已有研究表明，蛇莓总酚对卵巢癌（SKOV-3）、宫颈癌（HeLa）、子宫内膜癌（HEC-1B）、鼻咽癌（CNE）、胃癌（BGC-823）、肺癌（NCI-H460）细胞的增殖有良好的抑制作用[16-18]。同时，前人已证实了甲基硒半光氨酸（MeSeCys，NH2-CH（CO2H）-CH2-Se-CH3）[3]、γ-谷胺酰-甲基硒代半光氨酸（γ-glutamyl-MeSeCys，NH2-CH（CO2H）-（CH2）2-CO-NH-CH（CO2H）-CH2-Se-CH3）[4]等有机硒具有较强的抗癌活性。由于有机硒的药效远高于无机硒，因此若蛇莓中的抗癌活性成分与硒结合，可能会生成对癌症有独特疗效的含硒活性成分。然而，含硒活性成分必须从有机硒含量很高的蛇莓中提取，在自然条件下生长的蛇莓有机硒含量很低，很难从中提取含硒活性成分。该研究通过叶面喷硒的方式获得了有机硒高度富集的蛇莓，并有可能从富硒蛇莓中提取对癌细胞有显著抑制活性的含硒活性成分。由于该试验采用盆栽方式对蛇莓进行富硒培育，所以获得的富硒蛇莓样品较少，因此尚未对富硒蛇莓中有机硒的赋存形态进行系统的分析。目前，笔者已在室外对蛇莓进行大量的种植，并利用该研究成果对蛇莓进行富硒培育，然后对富硒蛇莓进行有机硒的提取，并用制备液相色谱法分离出不同成分的有机硒，再采用核磁共振、红外光谱、高效液相色谱-质谱连用等技术表征有机硒的结构，最后将分离出来的有机硒进行抗癌活性的检测，以期为天然含硒抗癌新药的研制提供重要参考。

4 结论

叶面喷施亚硒酸钠能有效增加蛇莓叶中有机硒的含量，采用256 ng/mL的亚硒酸钠溶液对蛇莓叶面进行10次喷施，每10 d喷硒1次可以获得有机硒含量较高的富硒蛇莓，其有机硒含量高达20.94 μg/g。

参考文献

[1] 周宜强，范竹雯，杨建宇.抗癌中草药[M].北京：化学工业出版社，2007：298-299.

[2] THOMSON C D.Assessment of requirements for selenium and adequacy of selenium status：A review[J].European journal of clinical nutrition，2004，58（3）：391-402.

[3] MEDINA D，THOMPSON H，GANTHER H，et al.Semethyselenocysteine：A new compound for chemoprevention of breast cancer[J].Nutrition and cancer，2001，40（1）：12-17.

[4] BLOCK E，BIRRINGER M，JIANG W Q，et al.Allium chemistry：Synthesis，natural occurrence，biological activity，and chemistry of Sealk（en）ylselenocysteines and their γglutamyl derivatives and oxidation products [J].J Agric Food Chem，2001，49（1）：458-470.

[5] ARNAULT I，AUGER J.Selenocompounds in garlic and onion[J].Journal of chromatography A，2006，1112（1）：23-30.

[6] 米秀博，邵树勋，汤鋆，等.湖北恩施地区天然富硒植物中硒形态的HPLC-ICP-MS分析[J].草业科学，2014，31（6）：1173-1177.

[7] 杨容甫，梅承恩，黄宝珍，等.水稻叶面喷硒提高大米中硒含量的防癌研究[J].癌症，1999，18（S1）：34-35.

[8] 杨会芳，梁新安，常介田，等.叶面喷施硒肥对不同蔬菜硒富集及产量的影响[J].北方园艺，2014（11）：158-161.

[9] 罗盛国，徐宁彤，刘元英.叶面喷硒提高粮食中的硒含量[J].东北农业大学学报，1999，30（1）：18-22.

[10] 苟体忠，唐文华，张文华，等.氢化物发生-原子荧光光谱法测定植物样品中的硒[J].光谱学与光谱分析，2012，32（5）：1401-1404.

[11] 崔海容，陈建华，谷家越，等.顺序注射HG-AFS法测定富硒农产品中无机硒和有机硒[J].分析科学学报，2005，21（5）：545-548.

[12] 李志玉，郭庆元，涂学文，等.大豆施硒效应和硒素积累特性的初步研究[J].中国油料，1994，16（1）：41-44.

[13] 张祥明，王允青，刘英，等.紫云英叶面喷硒效应和硒素积累特性研究[J].土壤通报，2005，36（6）：921-924.

[14] 可成友，夏丽娜，于亮，等.北五味子的富硒方法和富硒效应研究[J].中国药业，2010，19（16）：19-21.

[15] DAVIS A M.Selenium accumulation in Astragalus species[J].Agronomy journal，1972，64（6）：751-754.

[16] 薛紅卫.蛇莓药理与临床研究进展[J].中国中医药信息杂志，2002，9（9）：79-80.

[17] 段泾云，刘小平，李秦.蛇莓抗肿瘤作用研究[J].中药药理与临床，1998，14（3）：28.

[18] 彭博，胡秦，王立为，等.蛇莓总酚的抗肿瘤作用及免疫学机制的初步探讨[J].中国药理学通报，2007，23（8）：1007-1010.