广东省禽源大肠杆菌分离株的耐药性调查

温肖会　魏文康　丘婷　翟少伦　周秀蓉　吕殿红

摘要[目的]了解广东省不同地区禽源大肠杆菌的耐药情况。[方法]采用纸片扩散法对不同养禽场分离的229株大肠杆菌进行28种抗菌药物的耐药性试验。[结果]229株大肠杆菌对四环素、复方磺胺甲噁唑、阿莫西林和氨苄西林的耐药率较高，分别为89.1%、80.0%、76.9%和75.5%，其次是多西环素和链霉素（74.7%和68.6%），但阿米卡星耐药率最低（8.3%）。229株大肠杆菌存在多重耐药性，其中6株大肠杆菌可耐26种药物。[结论]广东省禽源大肠杆菌分离株耐药情况严重，存在多重耐药现象。养殖场应合理使用药物，加强细菌耐药性监测，研究结果为养殖场选用合适药物、控制细菌耐药性的产生和扩散提供了有效的理论依据。

关键词 禽；大肠杆菌；药敏试验；耐药性

中图分类号 S852.61 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2018）11-0074-04

大肠杆菌是大肠埃希氏菌（Escherichiacoli，Ecoli）的简称，隶属肠杆菌科埃希氏菌属。大肠杆菌在自然界中广泛存在，是人和动物的肠道共生菌和条件致病菌。不同动物感染后具有不同的临床症状和病理变化，且常与其他病原并发或混合感染，发病率和死亡率较高，给养殖业带来严重的经济损失。大肠杆菌血清型复杂，目前尚无理想的疫苗来预防，主要依靠抗生素进行治疗。抗生素的广泛使用造成动物源大肠杆菌的耐药菌株不断增加，耐药机制日趋复杂，多重耐药现象日益严重。动物源耐药菌株和耐药基因可通过食物链传给人类，危害人类健康，将来可能造成人类无药可用的严峻局面。笔者通过对广东省10个市（县）养殖场不同动物来源样品分离到的大腸杆菌进行了28种抗菌药物的敏感性试验，以期为养殖业合理有效地使用抗菌药提供参考，并为大肠杆菌的防制提供科学依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1菌株。

（1）受试菌株。2012年采集来自广州、花都、增城、东莞、四会、中山、台山、翁源、博罗、江门10个市（县）养殖场不同动物来源的样品，动物品种包括鸡、鸭、鹅和鸽子等。样品来源于病、死动物的肝脏、心血、卵黄、肠道、粪便和健康动物的泄殖腔棉拭子以及发病、健康家禽场的垫纸、水源、土壤等，经分离鉴定获得的229株大肠杆菌。其中56株来自鸭场，17株来自鹅场，134株来自鸡场，22株来自鸽场；分离自心血、肝、肺、肾等内脏70株，肛门拭子、垫纸、肠道及粪便139株，环境样品5株，鸭场水样15株；来源于健康动物及其养殖场119株，来源于病死动物及其养殖场110株。

（2）质控菌株。大肠杆菌标准株ATCC25922，由广东省农业科学院动物卫生研究所动物疫病诊断中心实验室保存。

1.1.2药敏纸片。共选用7类28种抗菌药物的药敏纸片，分别为β-内酰胺类[氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、阿莫西林、头孢他啶、头孢呋辛、头孢曲松、头孢唑林、头孢西丁、头孢哌酮、氨曲南（单酰胺环类）]、氨基糖苷类（阿米卡星、卡那霉素、妥布霉素、庆大霉素、链霉素、大观霉素、新霉素和奈替米星）、氯霉素类（氯霉素和氟苯尼考）、四环素类（四环素和多西环素）、磺胺类[复方磺胺甲噁唑（磺胺甲嗯唑/甲氧苄啶）]、硝基呋喃类（呋喃唑酮）、氟喹诺酮类（环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、诺氟沙星），均购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1.1.3培养基。麦康凯琼脂培养基、MH琼脂培养基、MH肉汤培养基等均购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1.1.4主要仪器与设备。立式灭菌器，购自山东新华医疗器械股份有限公司；电热鼓风干燥箱和电热恒温培养箱，购自上海一恒科学仪器有限公司；恒温振荡培养箱购自上海智城分析仪器制造有限公司；精密电子天平购自梅特勒一托利多仪器有限公司；游标卡尺购自上海台海工量具有限公司。

1.2方法采用美国临床实验室标准化委员会（CLSI）推荐的K-B（Kirby-Bauer）纸片扩散法进行药敏试验，同时以大肠杆菌标准株ATCC25922作为质控菌株。将229株大肠杆菌在麦康凯琼脂平板上划线、培养后，挑取单菌落接种于3mLMH肉汤内，37℃下培养16～18h，用MH肉汤将菌液稀释至0.5麦氏比浊管浓度。用灭菌棉签浸透调配的菌液，在试管壁上旋转，挤去多余液体，均匀涂抹于MH琼脂平板上，每次旋转60°，最后用棉签沿平板周边琼脂涂抹2圈，使整个平板涂布均匀。涂好后放置3～5min，待培养基表面水分吸干后，用无菌眼科镊子将药敏纸片贴在平板上，纸片间距不小于24mm，纸片中心距平皿边缘不小于15mm。37℃下培养16～18h后，使用游标卡尺测量抑菌圈直径。参照美国临床实验室标准化委员会（CLSI）2012M100-S22标准，根据抑菌圈直径判断受试大肠杆菌对28种抗菌药物的耐药性，个别CLSI没有列出但我国兽医中有应用的药物参照杭州天和微生物试剂有限公司提供的标准作为判定依据。

2结果与分析

2.1229株大肠杆菌分离株的总体耐药情况 药敏试验结果表明，广东省家禽养殖场大肠杆菌对28种抗菌药物的耐荮情况十分严重，其中对四环素、复方磺胺甲噁唑、阿莫西林和氨苄西林的耐药率较高，分别为89.1%、80.0%、76.9%、和75.5%；其次为多西环素和链霉素，耐药率分别为74.7%和68.6%；受试菌株对阿米卡星的耐药率最低，仅为8.3%；受试菌株对硝基呋喃类药物呋喃唑酮的耐药率也较低，为12.7%；临床分离的大肠杆菌对头孢西丁、奈替米星的耐药率均在10.0%以下；对头孢类药物的耐药率为9.2%～43.2%，其中对一代头孢类药物头孢唑啉的耐药率最高，为43.2%；所有菌株对氟喹诺酮类药物呈现不同程度耐药性，耐药率为34.5%-47.6%；受试菌株对氨基糖苷类药物的耐药性在不同药物间存在很大差异，对链霉素和卡那霉素的耐药率较高，分别为68.6%和41.5%；对新霉素和庆大霉素的耐药率为32.8%和32.3%（表1）。

2.2患病动物场与健康动物场大肠杆菌分离株的耐药率比较 对来源于患病动物场与健康动物场大肠杆菌对28种抗菌药物进行敏感性分析，发现无论是患病动物场还是健康动物场大肠杆菌分离株都对四环素、复方磺胺甲噁唑、多西环素、氨苄西林和阿莫西林表现出较高的耐药性，耐药率在65.0%以上；患病动物场大肠杆菌分离株除对头孢西丁、阿米卡星、氨苄西林/舒巴坦和奈替米星的耐药率低于20.0%以外，其他药物表现出不同程度的耐药性。患病动物场大肠杆菌分离株对大部分药物的耐药率均极显著高于健康动物场（P<0.01）。健康动物场大肠杆菌分离株除对奈替米星、阿米卡星、呋喃唑酮、氨苄西林/舒巴坦和头孢西丁比较敏感（耐药率分别为1.7%、2.5%、3.3%、5.0%、6.7%）外，其他药物呈现不同程度的耐药性，除上述高度耐药的5种药物和较为敏感的5种药物以外，对其余18种药物的耐药率为12.6%～57.1%；对于头孢类药物，229株大肠杆菌都对一代头孢类具有较高的耐药率，均在39.5%以上；229株大肠杆菌对二代头孢类的耐药率较低，特别是头孢西丁，耐药率低于11.8%；在氨基糖苷类药物中，健康动物场大肠杆菌分离株对链霉素有较强的耐药性，耐药率达57.1%；在氟喹诺酮类药物中，大肠杆菌对恩诺沙星的耐药率最高，为38.7%；健康动物场大肠杆菌分离株对氯霉素和氟苯尼考也表现出较高的耐药性，耐药率分别为45.4%和42.0%（表2）。

2.3229株大肠杆菌分离株多重耐药性分析 从图1可以看出，229株分离大肠杆菌分离株多重耐药情况严重而复杂，其中9耐的菌株数最多，有23株，占总菌株数的10.0%；每种多重耐药类型均有菌株分布，特别是2～16和18耐，均有8株以上菌株分布，共有173株，占总菌株数的75.5%；有1株大肠杆菌对28种药物均耐药，27、26、25耐也各有1株；有13株分离菌只对1种药物敏感，只有1株健康动物场的大肠杆菌分离株对28种药物敏感。

从图2可以看出，患病动物（场）110株大肠杆菌分离株的多重耐药性主要分布在9、12、14、18、19耐，共40株，占总分离株的36.4%；健康动物（场）119株大肠杆菌分离株的多重耐药性主要分布在3～10耐，共61株，占总分离株的51.3%。18耐以上的分離株，患病动物场有38株，占比34.5%；健康动物场有9株，占比7.6%。大肠杆菌耐药性与饲养管理和用药情况有关，抗生素用量越多、种类越复杂，其耐药性越严重，多重耐药现象也就越严重。在实际生产中，加强饲养管理，采取综合措施来预防疾病，少用抗菌药物，是控制细菌产生耐药性与多重耐药情况的必要方法。

3讨论与结论

随着我国养殖业集约化的发展、抗生素的出现和科技的进步，养殖业细菌性疾病得到了一定控制，但由于抗菌药物的不合理使用和抗生素滥用，导致细菌产生耐药性，特别是大肠杆菌耐药性问题尤为严重。20世纪50～60年代分离的大肠杆菌对兽医常用药物非常敏感，20世纪70年代分离菌产生了耐药性，20世纪80年代至90年代初分离菌对抗菌药的耐药性十分普遍，多重耐药性呈上升趋势。近年来，大肠杆菌病已成为畜禽养殖场主要细菌性疾病，给我国养殖业造成了严重的经济损失。

该研究通过对2012年1-11月广东地区10个市（县）229株家禽养殖场大肠杆菌分离株对28种抗菌药物的耐药情况进行了调查，结果发现229株大肠杆菌分离株对四环素、复方磺胺甲嗯唑、氨苄西林和阿莫西林高度耐药，可能与这4种药物通常作为家禽饲料药物添加剂使用有关。由于患病动物场用药量大、用药次数较多且长期使用氟喹诺酮类、氨基糖苷类、氯霉素类等药物，因此患病动物场大肠杆菌分离株对这几种药物的耐药性显著高于健康动物场。氯霉素在被禁用后仍然表现出很高的耐药率（55.5%），同类药物氟苯尼考也表现出较高的耐药率（51.5%）。此外，229株大肠杆菌分离株对氨苄西林的耐药率为75.5%，而对氨苄西林/舒巴坦的耐药率为10.5%，这2种药物联合使用后耐药率明显下降，提示养殖场在临床抗菌药物的选择上应尽量采用联合用药、交叉用药、轮换用药的方式，充分发挥抗生素间的协同作用，避免细菌与某单一药物长期接触。各养殖场应该严格控制在饲料和饮水中添加抗菌药物，应加强饲养管理，采取预防措施，重视疾病的前期预防，少用抗菌药物，控制并逐渐降低细菌耐药性和多重耐药现象。

抗菌药物的广泛使用、连续使用及使用方法不当，对细菌的生存环境产生了压力，这种环境压力因素可能通过多种机制导致病原菌对抗菌药物产生耐药性。229株大肠杆菌分离株对头孢菌素类药物也表现出较高的耐药率，特别是对一代头孢菌素的耐药率达39.5%；二代头孢菌素药物中，患病养殖场大肠杆菌分离株对头孢西丁的耐药率为11.8%，健康养殖场大肠杆菌分离株对头孢西丁的耐药率为6.8%；健康养殖场和患病养殖场大肠杆菌分离株对头孢呋辛的耐药率分别为37.2%和32.0%。这可能是因为家禽养殖场头孢菌素类药物的广泛使用，增加了耐头孢菌素类菌株的出现。该类药物还存在交叉耐药现象，一旦耐药菌传播扩散到人群中，将会造成人类临床治疗的困难，因此兽医临床要慎重使用此类药物。