大麦苗复合粉对荷瘤小鼠化疗的辅助作用及其机制研究

吕晓文 柳全文 侯兰梅 卞菲菲 宋新娜 张恩宁 付爱芹 张婷 王晓洁

摘要 [目的]探讨大麦苗复合粉对荷瘤小鼠化疗的輔助作用及其机制。[方法]采用 MTT法测定大麦苗复合粉体外对小鼠S-180瘤细胞的抑制作用和对巨噬细胞的促增殖作用，并筛选出适宜用量用于体内试验。建立小鼠S-180肿瘤模型，化疗药物5-氟尿嘧啶（5-FU）连用3 d，同时大麦苗复合粉连续灌胃15 d，观察其对荷瘤小鼠瘤质量、 肝脾指数及血细胞的影响。 [结果]化疗时配用大麦苗复合粉可显著提高荷瘤小鼠的抑瘤率为74.3%，单纯化疗组为45.9%，小鼠一般状态优于化疗组，且显著提高小鼠脾脏指数、中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞和嗜酸性粒细胞的数量（ P<0.05）；体外大麦苗复合粉有显著抑制小鼠S-180瘤细胞的作用，对巨噬细胞的作用同盐酸左旋咪唑。[结论]大麦苗复合粉有抵抗化疗药引起的淋巴细胞的减少，使化疗的同时不失去对免疫细胞的监控作用，并可减轻化疗药物的毒副作用。

关键词 大麦苗粉；绿茶粉；肿瘤；化疗

中图分类号 R151.4+1文献标识码 A文章编号 0517-6611（2018）31-0157-06

Abstract [Objective]To explore the auxiliary function of barley seedling compound power on chemotherapy in tumor bearing mice and its mechanism. [Method]MTT test was employed to measure the inhibitory effect of barley seedling compound power on S180 sarcoma cells and the proliferation promotion effect of barley seedling compound power on Macrophages， and then selected a suitable dosage for further vivo experiment. S180 sarcoma models of mice was built up， Chemotherapy drug（5FU） was used for 3 days in a row while barley seedling compound power for 15 days continuously. The influence of the quality of tumor， the liver spleen index and blood cells in tumor bearing mice was observed afterwards. [Result]Barley seedling compound power can obviously restain S180 sarcoma of the proliferation and on the amount of macrophages with Levamisole hydrochloride in vitro.Therefore， chemotherapy withbarley seedling compound power can significantly improve the inhibition rate by 74.3% of tumor bearing mice， while its rate of chemotherapy group （5FU） was only 45.9%. Besides， the general body state of the mice treated by chemotherapy with barley seedling compound power is better than that of chemotherapy group. And it can significantly improve the spleen index of mice， improve the number of the neutrophils， monocytes， lymphocytes and eosinophils （P<0.05）. [Conclusion]Barley seedling compound power has resistance to chemotherapeutic drugs induced lymphopenia， which dont lose monitoring impact on immune cells at the time of chemotherapy， and can reduce the side effects of chemotherapy drugs.

Key words Barley seedling compound power；Green tea powder；Tumor；Chemotherapy

肿瘤的化疗药物治疗是目前常规的肿瘤治疗方式之一，化疗药物对免疫细胞的杀伤则是化疗药物最大的毒副作用。在抗肿瘤中细胞免疫起着重要的作用，化疗能否成功与化疗期间化疗药物对机体免疫细胞的影响有密切关系[1-5]。大麦苗复合粉（已由烟台昊清生物科技有限公司转化生产出系列肿瘤病人化疗期间的营养品，如呵本等系列植物源蛋白复合粉），它的主要成分是大麦苗、绿茶、金银花、桑叶、荷叶等植物超微粉组成，富含抗氧化麦绿素多酚、酚青花素、β-胡萝卜素、硒、锗、黄酮、生物碱，膳食纤维等[6-7]。笔者课题组前期也进行了大量的相关研究，试验表明富锗、富硒大麦苗具有抗肿瘤、增强机体免疫力、保肝、保胃等功能[8-13]。

大麦苗复合粉是在大麦苗的基础上配以清热解毒的药食同源的植物绿茶等，旨在能够去除自由基毒素，平衡免疫力及减轻化疗药的毒副作用。大麦苗复合粉富含膳食纤维，有助于维持正常的肠道功能。该试验通过大麦苗复合粉对常规化疗方案的小鼠肿瘤模型的作用，观察大麦苗复合粉在体内外对肿瘤和免疫细胞的作用，探讨其作用机制，为临床应用提供试验方法和依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原料及主要試剂。大麦苗复合粉：由大麦苗30 g，绿茶30 g，桑叶20 g，荷叶10 g，金银花10 g，5种原料组成[大麦苗符合卫生部公告2012年第8号标准的规定；绿茶符合绿茶国家标准GB/T14456.1—2008；荷叶符合中国药典（2015版一部）荷叶项下要求；桑叶符合中国药典（2015 版一部）桑叶项下要求；金银花符合中国药典（2015版一部）金银花项下要求]。大麦苗复合粉的配制：按配方量称取5种原料超微粉使用。 ①体外试验：用RPMI 1640培养液，配成0.05、0.10、0.15、0.20 g/mL 4个浓度梯度溶液，用0.45和0.22 μm滤膜分别过滤除菌，现配现用。②体内试验：用灭菌的生理盐水配制为0.125 g/mL的溶液，现配现用。氟尿嘧啶注射液（批准文号：国药准字H12020959），天津金耀氨基酸有限公司；二甲基亚砜（DMSO）（AR），天津市科密欧化学试剂开发中心；四甲基偶氮唑兰（MTT）， Sigma公司。5-FU的配制：5-FU用灭菌生理盐水配制浓度为288 μg/mL，4 ℃保存备用。盐酸左旋咪唑的配制：灭菌生理盐水配成2.5 μg/mL溶液，0.45 μm滤膜滤菌，4 ℃保存，保存时间不能超过4 d，最好现用现配。MTT的配制：用pH 7.4，0.01 mol/L的PBS，配成5 mg/mL溶液，滤菌，4 ℃避光保存。RPMI-1640培养基，批号D406FA000 BBI LifeSciences公司。

1.1.2 动物。健康昆明种小鼠（雌性，体重18～25 g），购自山东绿叶制药有限公司实验动物中心，实验动物生产许可证号为SCXK（鲁）20090009；鼠肉瘤细胞S-180瘤株来自上海细胞所。

1.1.3 主要仪器。超净工作台；CO2恒温培养箱（SANYO）；MCO-17A倒置相差显微镜（COIC XDS-1B）；TDL-5离心机；电子天平；电热恒温水浴锅；生化培养箱。

1.2 方法

1.2.1 大麦苗复合粉体外对S-180瘤细胞抑制作用和巨噬细胞增殖作用试验。

1.2.1.1 大麦苗复合粉体外对S-180瘤细胞抑制作用试验。

取对数期生长S-180瘤细胞，用含10% FBS 的RPMI 1640 培养液配成密度为5×104～2×105 个/mL 的细胞悬液，接种于96 孔培养板，每孔100 μL，37 ℃、5%CO2培养箱培2 h后，设试验组：大麦苗复合粉4个梯度；化疗药物对照组（5-FU）；免疫增强剂对照组（盐酸左旋咪唑）；阴性对照组（RPMI 1640培养液），每组设6个重复，将以上各组药品取分别100 μL加入接种细胞的培养孔中。常规培养，24 h后，每孔加入20 μL 5 mg/mL MTT溶液，继续培养4 h，终止培养，弃去孔内上清。每孔加入150 μL DMSO，摇床振荡10 min，用酶标仪测波长490 nm 处OD值，计算S-180细胞抑制率，见公式（1）：

细胞生长抑制率=OD2-OD1OD2（1）

式中，OD1为试验组平均OD 值；OD2 为对照组平均OD值。

1.2.1.2 大麦苗复合粉体外对巨噬细胞增殖作用试验。

选取1只健康小鼠，断颈处死，以RPMI 1640培养液冲洗收集腹腔巨噬细胞至离心管中，1 500 r/min，离心5 min，弃上清，用 RPMI 1640基础培养基重悬，并将细胞密度调整到 5×104～ 2×105个/mL，接种到96孔细胞培养板中，每孔100 μL，37 ℃、5%CO2 培养箱培养2 h[14]，其后试验分组与试验方法同“1.2.1.1”，试验结束计算巨噬细胞增殖率，见公式（2）：

细胞生长增殖率=OD1OD2×100%（2）

式中，OD1为试验组平均OD 值；OD2 为对照组平均OD值。

1.2.2 大麦苗复合粉对化疗期荷瘤小鼠作用试验。

首先建立小鼠肿瘤模型，取对数期生长的小鼠S-180细胞，制成单细胞悬液，调整细胞浓度为1×107个/mL，无菌条件下用1 mL注射器将S-180细胞接种于小鼠右前肢腋下皮下，接种量为0.2 mL/只[9]。小鼠接瘤后第7天，将造模小鼠随机分为3组，每组6只。化疗药组：腹腔注射5-FU，0.2 mL/只，1次/d，连续3 d；大麦苗复合粉组：注射化疗药的同时灌胃大麦苗复合粉，0.2 mL/只，1次/d，连续15 d。肿瘤对照组：灌胃生理盐水，用量和时间同大麦苗复合粉组。正常对照组：不作任何处理。试验结束时，分别测小鼠体质量、瘤质重、肝脾质量，断头取血，五分类法常规测定血细胞，并按公式（3）、（4）分别计算抑瘤率、肝脾指数[15]。

抑制率=对照组平均瘤质量-试验组平均瘤质量对照组平均瘤质量×100%（3）

肝脾指数=肝脾质量（mg）体质量（g）×100%（4）

1.3 统计学处理

每个试验至少重复3次，对试验结果采用SPSS 17.0软件进行统计学处理，所有数据均采用平均数±标准差（±s）表示，F检验方差齐性，再根据方差齐性进行等方差或异方差的t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 大麦苗复合粉体外对S-180瘤细胞抑制作用和巨噬细胞增殖作用

2.1.1 大麦苗复合粉体外对S-180瘤细胞的作用。

由表1和图1可见，4个浓度的大麦苗复合粉均有抑制S-180瘤细胞的作用，且浓度在0.05～0.15 g/mL时，抑制率与剂量呈正相关；当浓度大于0.15 g/mL时，大麦苗复合粉对S-180瘤细胞的抑制率呈下降趋势。盐酸左旋咪唑对S-180瘤细胞的抑制率为负值。4个浓度的大麦苗复合粉与5-FU组相比，均具有极显著差异（P<0.01）。

2.1.2 大麦苗复合粉体外对巨噬细胞增殖的作用。

由表2和圖2可知，4个浓度的大麦苗复合粉对巨噬细胞增殖率随浓度增加而呈下降趋势。4个浓度的大麦苗复合粉与盐酸左旋咪唑组相比，均无显著性差异。

2.2 大麦苗复合粉体外对化疗期间荷瘤小鼠的作用

2.2.1 大麦苗复合粉对荷瘤小鼠机体一般状态的影响。

由图3可见，试验前后，大麦苗复合粉组小鼠体毛色亮且光滑，小鼠活泼；肿瘤对照组：小鼠体毛色没有差别；化疗组：试验前小鼠体毛色光亮，试验后小鼠体毛竖起变稀疏不光滑，小鼠萎靡。

2.2.2 大麦苗复合粉对荷瘤小鼠体质量和瘤质量的影响。

由表3和图4可见，体质量：试验结束后，正常组和肿瘤对照组体质量差值为正值，说明试验后体质量是增加的，大麦苗复合粉组和化疗组体质量差值是负值，说明试验后体质量是减少的。瘤质量：大麦苗复合粉组（P<0.01）和化疗组（P<0.05）显著低于肿瘤对照组，大麦苗复合粉组显著低于化疗组（P<0.05）。抑瘤率：化疗组的肿瘤抑瘤率达到45.9%，大麦苗复合粉组的抑瘤率达到74.3%。

2.2.3 大麦苗复合粉对荷瘤小鼠免疫器官的影响。

由表4可见，肝脏指数：大麦苗复合粉组、化疗组和肿瘤对照组均显著高于正常组（P<0.05）；脾脏指数：大麦苗复合粉组显著高于肿瘤对照组和化疗组（P<0.05）。

2.2.4 大麦苗复合粉对荷瘤小鼠免疫细胞的影响。

针对血常规检测报告的24项中的免疫细胞进行统计学分析，见表5。

红细胞总数：大麦苗复合粉组和化疗组均显著低于正常组（P<0.05）。血小板总数：大麦苗复合粉组、化疗组显著高于肿瘤对照组（P<0.05）。白细胞总数：试验组与对照组均无显著差异。淋巴细胞绝对值：大麦苗复合粉组显著高于肿瘤对照组（P<0.05）和化疗组（P<0.01），化疗组显著低于肿瘤对照组（P<0.05）。单核细胞绝对值：大麦苗复合粉组和化疗组显著高于肿瘤对照组（P<0.01），且大麦苗复合粉组显著高于化疗组（P<0.01）。嗜中性粒细胞绝对值：大麦苗复合粉组显著高于肿瘤对照组（P<0.01）和化疗组（P<0.05）。嗜酸性粒细胞绝对值：大麦苗复合粉组显著高于化疗组（P<0.05）和肿瘤对照组（P<0.01）。嗜碱性粒细胞绝对值：大麦苗复合粉组（P<0.01）和化疗组（P<0.05）显著低于肿瘤对照组。

3 讨论

该研究通过大麦苗复合粉体外对小鼠S-180瘤细胞和巨噬细胞的作用及体内对荷瘤小鼠化疗辅助抗肿瘤的试验，初步观察到，大麦苗复合粉在体外对S-180瘤细胞有一定的抑制作用，对巨噬细胞的增殖作用与免疫增强剂盐酸左旋咪唑没有差异，但随浓度的增加有下降的趋势。体外试验大麦苗复合粉在0.10～0.15 g/mL浓度范围内对S-180瘤细胞的抑制作用呈正相关，而对巨噬细胞的增殖作用下降也不是特别明显，所以在体内试验时选择0.125 g/mL的浓度灌胃，结果证明了大麦苗复合粉对化疗期间的肿瘤小鼠具有一定的辅助抗肿瘤作用。

该试验从免疫器官分析：大麦苗复合粉组、化疗组和肿瘤对照组肝指数均显著高于正常组，肝脏是机体主要的代谢解毒器官，肝指数的增加提示以上3种状态均使肝功能活性增加；大麦苗复合粉组、肿瘤对照组和化疗组的脾指数显著高于正常组，大麦苗复合粉组又显著高于肿瘤对照组和化疗组，这和体外试验大麦苗复合粉组与免疫增强剂盐酸左旋咪唑无差异相一致。从免疫细胞分析：化疗药5-FU组红细胞总数、淋巴细胞绝对值、单核细胞绝对值、嗜中性粒细胞明显低于正常组，而大麦苗复合粉组的淋巴细胞绝对值、单核细胞绝对值、嗜中性粒细胞绝对值和嗜酸性粒细胞绝对值都显著高于化疗组。综合这些结果可见，大麦苗复合粉可有效减轻5-FU引起的淋巴细胞、单核细胞和粒细胞数量降低，从而缓解5-FU引起的免疫细胞下降，其机制可能是化疗药5-FU杀伤肿瘤细胞时，死伤的肿瘤细胞通过损伤识别模式（DAMP）引起机体的一系列免疫应答反应，如肝脾指数增加，单核细胞、血小板增加，但淋巴细胞绝对值且显著低于正常组。淋巴细胞降低的原因可能是：当DAMP启动免疫应答从固有免疫转化到适应性免疫应答时，出现以T淋巴细胞为主的快速分裂增殖，此时5-FU则抑制了其DNA的合成，使淋巴细胞的数量明显减少。而大麦苗复合粉中的大麦苗、绿茶、荷叶、桑叶均含丰富的叶绿素、黄酮、麦绿素多酚，青花素、β-胡萝卜素、硒、锗、超氧化物歧化酶、生物碱等[6-7]，可较强地去除自由基，加速体内肿瘤细胞死亡毒素的代谢，避免了这些肿瘤细胞死亡毒素引起的DAMP强烈的免疫应答而导致的T淋巴细胞因过速分裂增殖被5-FU抑制最终造成T淋巴细胞减少。因而大麦苗复合粉起到了调节免疫细胞平衡的作用。体内试验结果显示，大麦苗复合粉组的肿瘤抑制率74.3%明显高于化疗组45.9%，也支持了这一点，即在化疗时配合使用大麦苗复合粉起到了调节免疫细胞平衡的作用，淋巴细胞绝对值明显高于单独化疗组，抗肿瘤的效果增加。

肿瘤本身以及化疗药都会引起机体和肿瘤微环境产生一定的无菌性炎症反应[16]，嗜碱性粒细胞是导致变态反应的主要细胞，而嗜酸性粒细胞则是抗过敏的主要细胞[17-18]。从试验结果可见，大麦苗复合粉可显著提高嗜酸性粒细胞绝对值，同时显著降低嗜碱性粒细胞绝对值，说明大麦苗复合粉具有一定的抗炎症反应。这可能是因为大麦苗复合粉中大麦苗、绿茶、荷叶、桑叶和金银花均有清热解毒的作用[19-21]，大麦嫩叶中的某些蛋白质能中和有害物质，如糖蛋白DI-GI具有抗炎症效应[22]，麦绿素多酚、花青素等都是抗炎症、抗氧化的功能成分[23]，如金银花中含有的绿原酸腹腔注射0.25 g/kg，能抑制大鼠巴豆油角叉菜性脚肿[24]。肿瘤相关性炎症反过来又可以促进肿瘤细胞不断地更新和增殖[25-26]，可以抑制肿瘤相关性炎症反应，抑制化疗引起的炎症，可改善癌症的治疗效果，提高患者的存活率[27]。