蚯蚓体内外分泌液的抗菌活性研究

张显忠　张欣然　武晓雯　袁燕涛　郭东会

摘要 [目的] 探究蚯蚓体内外分泌液的抗菌活性。[方法]分别将蚯蚓体内外分泌液作用于不同的临床致病菌株，筛选对体内外分泌液的敏感菌种，并在此基础上分析温度、pH、蚯蚓体内外分泌液浓度等因素对蚯蚓分泌液抗菌效果的影响。[结果] 蚯蚓体内外分泌液均对金黄色葡萄球菌有良好的抗菌效果；诱发最佳抗菌效果的环境条件为：内分泌液原液、30 ℃、pH 7～8；外分泌液原液、60 ℃、pH 7～8。[结论]研究结果为更好地开发与利用蚯蚓资源提供了理论基础和实践依据。

关键词 蚯蚓；分泌液；抗菌效果；金黄色葡萄球菌

中图分类号 S899.8 文献标识码

A 文章编号 0517-6611（2018）13-0095-03

Study on the Antibacterial Activity of Internal and External Secretory Fluid of Earthworm

ZHANG Xianzhong，ZHANG Xinran，WU Xiaowen et al

（School of Life Sciences，Taishan Medical University，Tai′an，Shandong 271000）

Abstract [Objective] To study the antibacterial activity of the internal and external secretory fluid of earthworm.[Method] The internal and external secretory fluid of earthworms were conducted on different clinical pathogens to screen out sensitive strains of internal and external secretory fluids .On this basis，the influences of temperature，pH，the concentration of internal and external secretory fluid of earthworms and other environmental factors on the antibacterial effect of secretory fluid of earthworm were analyzed.[Result] The internal and external secretory fluids of earthworm had good antibacterial effects on Staphylococcus aureus.The environmental conditions to induce the optimum antibacterial effect were as follows：the original liquid of the internal secretory fluid，30 ℃，pH 7-8；the original liquid of external secretory fluid，60 ℃，and pH 7-8.[Conclusion] The research results provided theoretical basis and practical basis for better exploitation and utilization of earthworm resources.

Key words Earthworms；Secretory fluid；Antibacterial effect；Staphylococcus aureus

蚯蚓通常生活在具有大量致病微生物的環境中，生命力极强且很少患病[1]。蚯蚓不仅作为分解者在生态系统中占有重要地位，降低工业造成的环境污染，保护生态环境，实现农业的可持续发展[2]，同时由于体内存在多种抗菌成分，当受到机械、电击、化学及热刺激时分泌的黄色分泌液中也含有抗菌肽等活性成分，具有较强的抑菌活性[3]。因此，蚯蚓不仅可作为优质的动物蛋白应用于生产生活中，而且毒副作用小，在当今抗药性细菌泛滥的背景下更加安全环保的蚯蚓分泌液有望替代抗生素，具有巨大的生化药理潜力。笔者通过敏感性测定试验筛选出对蚯蚓体内外分泌液的敏感菌种，并分析了蚯蚓分泌液的抗菌效果以及环境因素对其影响，以期为更好地开发与利用蚯蚓资源提供理论基础和实践依据。

1 材料与方法

1.1 材料 赤子爱胜蚓（Eisenia foetida），购自众翔蚯蚓养殖专业合作社。大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、弗氏柠檬酸杆菌，均由泰山医学院附属医院微生物实验室提供。其他试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 蚯蚓外分泌液的提取。 取蚯蚓250 g，用清水反复冲洗，浸泡30 min，以便吐净泥沙；再用无菌蒸馏水冲洗3～5次，用滤纸吸取体表多余水分。将蚯蚓于60 ℃水浴条件下热刺激5～10 s[4]，待分泌出黄色分泌液后收集转移至无菌50 mL离心管中，20 000 r/min离心10 min，取上清液，重复离心1次后，用一次性针式滤器过滤备用。

1.2.2 蚯蚓内分泌液的提取。 取已提取外分泌液的蚯蚓250 g，沥干体表水分，-12 ℃下预冷处理20 min，匀浆器研磨，将液体经3层纱布过滤于50 mL离心管中，20 000 r/min离心10 min，取上清液，重复离心1次后，用一次性针式滤器过滤备用。

1.2.3 不同菌株对蚯蚓分泌液的敏感性测定。 取直径5 mm的药敏专用滤纸片，高压灭菌干燥。吸取50 μL内（外）分泌液，滴于滤纸片上。 制备大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、弗氏柠檬酸杆菌，菌液浓度均为15×108个/mL， 分别涂布于MH培养基[5]，并将上述含分泌液的滤纸片均匀贴到培养基上。置于恒温培养箱中37 ℃培养18～20 h，试验重复3次，观察并测量抑菌圈直径，取平均值。

1.2.4 不同温度对分泌液抗菌效果的影响。 采用热刺激法提取蚯蚓外分泌液，设置外分泌液的温度梯度分别为60、70、80、90、100 ℃；内分泌液于室温条件下提取，因此温度梯度设置为30、40、50、60和70 ℃。

取5支10 mL无菌离心管，各加入蚯蚓外分泌液600 μL，分别在60、70、80、90、100 ℃下加热10 min[6]。吸取50 μL各温度梯度的外分泌液，滴于滤纸片上。将蚯蚓分泌液敏感菌株涂布在培养基上，滤纸片置于其中，每个培养基上做5个梯度，设置3次重复试验，观察并测量抑菌圈的直径，取平均值。另取5支10 mL无菌离心管，各加入蚯蚓内分泌液600 μL，分别在30、40、50、60和70 ℃下加热10 min。吸取50 μL各温度梯度的内分泌液，操作同上，观察并测量抑菌圈直径，取平均值。

1.2.5 不同浓度对分泌液抗菌效果的影响。排列6支试管，分别标记为1～6，1号试管仅加入600 μL蚯蚓内（外）分泌液作为对照，2～6号试管采用倍比稀释法[7]进行稀释，浓度依次稀释2、4、8、16、32倍，吸取50 μL各浓度梯度内（外）分泌液，滴于滤纸片上。将滤纸片置于涂布有敏感菌的培养基上，每个培养基做5个梯度，设置3次重复试验。观察并测量抑菌圈直径，取平均值。

1.2.6 不同pH对分泌液抗菌效果的影响。配制不同pH缓冲溶液（pH 5的柠檬酸-柠檬酸钠溶液，pH分别为6、7、8的PBS缓冲液，pH 9的碳酸钠-碳酸氢钠溶液[8]；取各pH梯度缓冲液600 μL与蚯蚓内（外）分泌液等量混合。吸取50 μL各pH梯度的内（外）分泌液，滴于滤纸片上。将滤纸片置于涂布有敏感菌株的培养基上，每个培养基上做5个梯度，设置3次重复试验。观察并测量抑菌圈直径，取平均值。

2 结果与分析

2.1 不同菌株对蚯蚓分泌液的敏感性测定 由图1可知，对蚯蚓内、外分泌液最敏感的菌种均为金黄色葡萄球菌[9]，肺炎克雷伯菌效果次之，大肠埃希氏菌第三，而弗氏柠檬酸杆菌没有任何现象产生。作用于同一菌种时，内分泌液抑菌圈直径均大于外分泌液抑菌圈直径。究其原因，应是由于提取方法不同所致。提取外分泌液时，水浴加热可能破坏其中一部分有效成分，导致外分泌液的抑菌效果普遍稍弱于内分泌液。

2.2 不同温度对分泌液抗菌效果的影响 从图2可以看出，对于内分泌液，30～50 ℃时均有抑菌圈出现，其中30 ℃时抑菌圈最大，随着温度的升高，抑菌圈逐渐缩小，60 ℃时抑菌圈已完全消失。究其原因，可能是因为蚯蚓为变温动物，体温会随着外界环境的变化而上下波动，有一定的耐受范围，但随着温度的持续上升，高温会破坏有效成分的结构，导致抗菌能力消失[10]。从图3可以看出，对于外分泌液，60～100 ℃时均有抑菌圈出现，60 ℃时抑菌圈最大，随着温度的升高，抑菌圈逐渐缩小。究其原因，可能是因为高温破坏了部分有效成分的结构，使抑菌效果变差，但总体来看，外分泌液的热稳定性相对较高，当温度升至100 ℃时仍保留了部分抑菌活性。内外分泌液对温度表现出这样的差异，可能是蚯蚓在漫长的进化过程中与环境相互作用而逐步形成的，是自然选择的结果[11]。

2.3 不同浓度对分泌液抗菌活性的影响 从图4可以看出，蚯蚓内、外分泌液均为蚯蚓原液的抑菌效果最明显，

抑菌圈随浓度的降低而逐渐缩小，至32倍时几乎不可测，且同样浓度的内分泌液抑菌圈直径略大于外分泌液。究其原因，可能与内、外分泌液不同的提取方式有关[12]。

2.4 不同pH对分泌液抗菌活性的影响 从图5可以看出，当pH为5、7、8时蚯蚓内外分泌液抑菌圈直径较大，pH为6和9时抑菌圈直径较小。究其原因，pH 7～8的环境与蚯蚓生活的土壤所需pH相近[13]，因此内外分泌液的抗菌效果达到最大，而pH为5时出现一个明显的峰值，可能与缓冲液本身有关，较低的pH抑制了金黄色葡萄球菌的生长，对内外分泌液的抑菌产生一定的干扰。当pH为9时，外分泌液的抑菌圈均略大于内分泌液的抑菌圈，可能是由于内分泌液比外分泌液对外界pH的改变更加敏感所致。

3 讨论与结论

该研究改变了通过在恒温箱内长时间溶解来获取蚯蚓内分泌液的传统方法，采用低温匀浆器研磨，将温度对蚯蚓内分泌液中活性成分的影响降至最低，另外采用一次性针式滤器过滤蚯蚓分泌液，很大程度上排除了外源微生物对试验的干扰，提高了试验结果的准确性。该研究证实了蚯蚓体内外分泌液都具有较强的抑菌效果，但由于采用热刺激法[14]提取蚯蚓外分泌液，一定会造成蚯蚓外分泌液中抗菌活性物质的损失，总之蚯蚓内分泌液的抗菌效果强于外分泌液，也从侧面说明了温度对蚯蚓分泌液抗菌效果的影响巨大。诱发蚯蚓分泌液发挥最大抗菌效果的环境条件如下：在30 ℃， pH 7～8时，蚯蚓内分泌液原液的抗菌效果最佳；在60 ℃，

pH为7～8时，蚯蚓外分泌液原液的抗菌效果最佳。综上所述，不论是在生产中还是生活中，在对蚯蚓分泌液进行开发利用时，应特别注意外部理化因素尤其是温度对其带来的干扰，选择最优条件，使其发挥出最大作用。

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