不同提取方法所得迷迭香净油的品质研究

陈明 张文龙 杨上莺 钱建文 念小魁 徐兰兰 袁林翠

摘要[目的]探讨传统方法和绿色方法提取的迷迭香净油的品质差异。[方法]通过对迷迭香净油的感官指标、组成成分、主要活性物质的含量以及清除DPPH自由基（DPPH·）的能力进行分析，比较回流提取法、油提法和超声油提法所得迷迭香净油的品质。 [结果]回流提取法和超声油提法制备的迷迭香净油在感官和得率等指标上相近。3种迷迭香净油均含有多种芳香成分和维生素E（VE），超声油提迷迭香净油（Ab-us）VE含量最高，回流提取迷迭香净油（Ab-cv）VE含量最低，油提取迷迭香净油（Ab-o）还含有一定量的甾醇。Ab-us含有迷迭香酸，其抗氧化物的含量最高，体外抗氧化活性和贮藏稳定性优于其余2种净油，是具有开发价值的天然抗氧化剂。[结论]研究可为迷迭香净油的制备及工业应用提供理论依据。

关键词迷迭香净油；超声油提取法；抗氧化活性

中图分类号TS264.3文献标识码A文章编号0517-6611（2018）05-0178-05

Abstract[Objective]To study the quality difference of rosemary absolute oil which was extracted by traditional method and green method. [Method]Rosemary absolute oils extracted by heat reflux extraction， oil extraction and ultrasoundassisted oil extraction were compared through the analysis of sensory index， chemical compositions， content of active ingredients and scavenging effects of DPPH radicals. [Result]Results showed that the sensory and yield of rosemary absolute oils extracted by heat reflux extraction and ultrasoundassisted oil extraction were similarity and better than that extracted by oil extraction. All of the rosemary absolute oils contented multiple aroma constituents and vitamin E （VE）. Among them rosemary absolute oil extracted by ultrasoundassisted oil extraction （Abus） had the highest content of VE while rosemary absolute oil extracted by heat reflux extraction （Abcv） had the lowest. Rosemary absolute oil extracted by oil extraction also contented sterol. Rosmarinic acid was found in Abus. Abus not only had obvious advantages on the antioxidant content， but also on the antioxidant activity in vitro and storage stability. [Conclusion]The study can provide a theoretical basis for the preparation and industrial application of rosemary oil.

Key wordsRosemary absolute oil；Ultrasound assisted oil extraction；Antioxidant activity

迷迭香是唇形科迷迭香屬多年生常绿亚灌木，是目前公认的具有高效抗氧化作用且安全无毒的香料作物。迷迭香原产地中海国家，云南气候条件适宜，成功引种迷迭香，且形成了一定规模[1]。迷迭香香气清凉、浓郁并带有甜樟脑的气息，因而被作为香料用于食品、日化品等产品中。此外，迷迭香还具有防腐、抗菌、提高记忆力等功效[2-5]。迷迭香净油是迷迭香经有机溶剂提取后所得浸膏的乙醇抽提物，属于天然抗氧化剂。迷迭香净油含有多种抗氧化成分，其抗氧化成分之一鼠尾草酸在净油制备过程中将会分解为亲脂性更强的二萜类物质，这些萜类物质在100 ℃以上仍然具有抗氧化性。Guo等[6]研究发现，迷迭香提取物在240 ℃油炸环境中被氧化后生成的二级和三级代谢产物仍然具有稳定的抗氧化活性，弥补了一些天然抗氧化剂只能在较低温度下保持抗氧化活性的缺陷[7]。同时，迷迭香净油与具有一定潜在毒性[8]的人工合成抗氧化剂[2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）、特丁基对苯二酚（TBHQ）和丁基羟基茴香醚（BHA）等]相比，安全性较高。综上所述，迷迭香净油在高温食品中具有一定的应用前景。

然而目前净油的提取方式还局限于传统的有机溶剂提取，即使用石油醚等弱极性溶剂对迷迭香原料进行提取制得浸膏，之后再用乙醇进行萃取、浓缩。这种方式虽然简单，但是提取时间长、能耗高，提取溶剂也具有一定毒性。基于此，使用弱极性的食用油作为提取溶剂代替石油醚，则可以提高迷迭香净油产品的安全性。近年来，不论是采用新型绿色溶剂还是新提取技术（如超声波）制备迷迭香净油的报道都比较少。而各提取方法又各有优势，导致迷迭香净油的得率和品质有所差别。因此，笔者从迷迭香净油的品质出发，探讨了传统方法和绿色方法提取的迷迭香净油在感官、理化、组成和活性等方面的差异，为迷迭香净油制备方法的研究和工业应用提供理论依据。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1原料。迷迭香干燥粉末，水分含量为9.4%，过40目筛；葵花籽油，昆明沃尔玛惠宜。

1.1.2主要试剂。没食子酸标准品，贵州迪大生物科技有限公司；福林酚试剂，山西西亚化学工业有限公司；2，2-联苯基-1-苦基-肼基（DPPH），Alfa Aesar；BHT（99%），山东西亚化学股份有限公司；鼠尾草酸（98%）、鼠尾草酚（98%）、迷迭香酸（98%）和熊果酸（98%），均为中国江苏永健医药科技有限公司产品；正己烷、无水乙醇（提取用）、碳酸钠、甲醇、磷酸均为国产分析纯试剂；无水乙醇（检测用）、乙腈，均为国产色谱纯试剂。

1.1.3主要仪器。

PTHW型5 000 W加热套，山东鄄城华鲁电热仪器有限公司；PC-420型磁力搅拌器，美国Corning；100 D型超声波发生器，北京宏祥隆生物科技有限公司；5804R型冷冻离心机，德国Eppendorf；T6型紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限公司；6890-5975 N型气相色谱/质谱仪，美国Agilent；2695型HPLC液相色谱仪，美国Waters。

1.2方法

1.2.1迷迭香净油的提取。

1.2.1.1回流提取法。

称取适量迷迭香粉末，按料液比1∶20（W/W）加入正己烷，回流提取2 h，得到提取液。过滤后取滤液，于50 ℃下减压浓缩至干。之后加入其2.5倍体积的无水乙醇，充分振荡萃取。将乙醇萃取液于8 000 r/min下离心15 min，取上清液于50 ℃减压浓缩，待乙醇完全蒸干后得到回流提取迷迭香净油（Ab-cv）。

1.2.1.2油提法。

称取适量迷迭香粉末，按料液比1∶20（W/W）加入葵花籽油后在室温下搅拌提取2 h，得到提取液。过滤后取滤液，在滤液中加入其2.5倍体积的无水乙醇，充分振荡萃取，取乙醇层萃取液，于50 ℃减压浓缩，然后于-15 ℃下冷冻过夜以完全分离残留油脂。冷冻液离心20 min（8 000 r/min），取上清液于50 ℃下减压浓缩，待乙醇完全蒸干后得到油提取迷迭香净油（Ab-o）。

1.2.1.3超声油提法。

称取适量迷迭香粉末，按料液比1∶20（W/W）加入葵花籽油后，在功率为400 W的超声波下搅拌提取15 min，过滤后取滤液，在滤液中加入其2.5倍体积的无水乙醇，充分振荡萃取，取乙醇层萃取液，于50 ℃减压浓缩，然后于在-15 ℃下冷冻过夜以完全分离残留油脂。冷冻液离心20 min（8 000 r/min），取上清液于50 ℃下减压浓缩，待乙醇完全蒸干后得到超声油提迷迭香净油（Ab-us）。

1.2.2

感官评价。以15位专业人员组成感官评定小组，对不同提取方法所得迷迭香净油进行感官评价，分别对比其在透明度、色泽、流动性和气味方面的差异。

1.2.3理化指标检测。

1.2.3.1净油得率。

按照式（1）计算迷迭香净油的得率。

得率（%）=m1/m2×100（1）

式中，m1为迷迭香净油的质量（g），m2为用于提取的迷迭香粉末的质量（kg）。

1.2.3.2总酚含量。

采用Folin-Ciocalteu法建立用于总酚含量测定的没食子酸标准曲线[9]，线性回归得到标准曲线方程y=0.024 8x-0.104 0。该方程式的相关系数为0.995，线性检测范围为0～50 μg/mL。分别取适量不同提取方法所得迷迭香净油，用无水乙醇配制为2 mg/mL的溶液，用Folin-Ciocalteu法测定并根据回归方程计算没食子酸质量浓度ρ（GAE），然后按照式（2）计算迷迭香净油的总酚含量。

总酚含量（mg GAE /g）=（ρ× D）× V /（W×103）（2）

式中，D为测定样品中没食子酸质量浓度的稀释倍数，V为定容体积（mL），W为迷迭香净油的质量（g），ρ为没食子酸当量（μg GAE/mL）。

1.2.4组成成分检测。

使用6890-5975 N型气相色谱-质谱仪（GC-MS）检测3种迷迭香净油的主要化学成分。准确量取3种迷迭香净油样品以及葵花籽油的乙醇萃取物各25 μL，用无水乙醇稀释至1 mL，于GC-MS进样分析，并以葵花籽油的乙醇萃取物作为空白对照。

仪器条件：Agilent 6890-5975 N气相色谱-质谱仪，HP-5MS石英毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）。

色谱条件：载气为高纯氦气；流速1.0 mL/min；进样量2 μL；分流比10∶1；进样口温度280 ℃；升温程序为柱温50 ℃保持1 min，以6 ℃/min升至280 ℃，保持10 min。

质谱条件：扫描范围41～510 aum；电离电压70 V；离子源温度230 ℃；传输线温度280 ℃；扫描方式为全扫描。

1.2.5主要活性单体检测。

使用2695型高效液相色谱仪检测迷迭香净油中主要活性单体（鼠尾草酸、鼠尾草酚、迷迭香酸和熊果酸）的含量。

1.2.5.1

样品前处理。准确称取0.5 g（精确至0.001 g）迷迭香净油样品和葵花籽油的乙醇萃取物至5 mL容量瓶中，无水乙醇定容至刻度，经0.22 μm微孔滤膜过滤后用于迷迭香酸和熊果酸的检测；同时取上述溶液0.5 mL至25 mL容量瓶中，用无水乙醇定容，经0.22 μm微孔滤膜过滤后用于鼠尾草酸和鼠尾草酚的检测。

1.2.5.2仪器条件。Waters Symmetry C18色谱柱（4.6 mm×250 mm×5 μm）；流动相：A相为乙腈，B相为0.5%磷酸-水溶液；流速1 mL/min；柱温35 ℃；检测波长210 nm；进样量5 L；梯度洗脱：0～50 min，10% A；50～70 min，75% A；70～75 min，100% A；75～80 min，10% A。

1.2.6抗氧化活性测定。

以BHT为阳性对照，按照Zeng等[10]所述方法测定并计算Ab-cv、Ab-o和Ab-us对DPPH自由基（DPPH·）的清除率。

1.2.7贮藏期测定。

将3种不同工艺得到的迷迭香净油放置于4 ℃冰箱中贮藏，分别测定其在贮藏1、3、6和12个月后的总酚含量，以此来监测不同工艺对迷迭香净油活性成分贮藏时间的影响。

2结果与分析

2.1迷迭香净油感官评价

不同提取方式得到的迷迭香净油在外观上有不同的表现。如表1所示，Ab-us和Ab-o透明度好，Ab-cv的颜色黑且浑浊，这可能与溶剂的萃取性能有关，说明正己烷可将较多杂质提取出来。Ab-us呈棕黄色，颜色比Ab-o深，说明迷迭香中的非极性色素在超聲波的辅助下被更充分地提取出来。Ab-cv香气更浓烈，Ab-o香气淡，这是因为低温提取不能使香气成分很好地溶出，但在辅助超声波后，迷迭香的特征香气成分也得到较好地提取。综合比较可知，Ab-cv和Ab-us感官质量更佳。

2.2迷迭香净油总酚含量分析

Ab-cv、Ab-o和Ab-us的得率及总酚含量如表2所示。Ab-o的得率和总酚含量均最低，得率比Ab-cv和Ab-us分别低41.6和315 g/kg，这说明单纯使用葵花籽油作为溶剂，在室温下提取效果欠佳。但Ab-us的得率和总酚含量高于Ab-cv和Ab-o，说明经过超声波处理后，总酚类物质更容易被提取出来[11]。Ab-cv的总酚含量和得率与Ab-us差异不大，因此从得率和总酚含量上看，Ab-cv和Ab-us的品质更好。

2.3迷迭香净油组成成分分析

图1为迷迭香净油总离子流图（TIC），由峰面积归一化法得出各组分的相对含量，分别分离鉴定出26种（Ab-cv）、28种（Ab-o）和29种（Ab-us）化合物，主要是醇类、烯类、酯类、酮类及少数其他化学物质。同时，葵花籽油的乙醇萃取物并没有检出上述物质，说明葵花籽油作为溶剂在经过乙醇萃取等后续工艺后不存在残留，不会对迷迭香净油的成分造成影响。

表3分析了迷迭香净油的具体组成成分。3种迷迭香净油均在8～20 min内检测到9种主要的致香成分，分别为百里香素、桉树脑、柠檬烯、芳樟醇、松油烯-4-醇、樟脑、龙脑、α-萜品醇和石竹烯，这一结果与前人的研究结论一致[12-14]。由图1a和1b可知，Ab-o和Ab-us在保留时间30～40 min范围内检出的成分主要是酯类、酮类和杂环类化合物，这说明葵花籽油作为提取溶剂能够从迷迭香中得到更多更为复杂的成分（杂环类化合物），极大地丰富了迷迭香净油的化学组成。Ab-cv和Ab-us在39 min时均检出角鲨烯，含量分别为0.78%和0.36%，说明迷迭香中含有少量角鲨烯。Ab-cv、Ab-o和Ab-us在43 min处均检出VE。在辅以超声波后，VE在葵花籽油中的溶出表现出一定程度的增加。此外，Ab-o在45～48 min有3个明显的峰，分别是菜油甾醇（1.42%）、豆甾醇（2.37%）和谷甾醇（13.05%）。综上所述，超声油提法能尽可能多地溶出迷迭香中的挥发性成分，丰富迷迭香净油的组成。

2.4迷迭香净油抗氧化单体含量分析

采用高效液相色谱法（HPLC）检测迷迭香净油和葵花籽油乙醇萃取物，其主要活性单体的含量如图2所示。葵花籽油乙醇萃取物中没有检测到目标物质，说明油提法和超生油提法使用葵花籽油作为溶剂不会对迷迭香净油的主要抗氧化单体造成影响。在所有迷迭香样品中，鼠尾草酸的含量均远远高于其余2种检出物质。而Ab-cv的鼠尾草酸、鼠尾草酚和熊果酸的含量均低于Ab-o和Ab-us，虽然回流提取法在提取时的温度比油提法高很多，但是温度的升高并没有增加活性成分的含量，甚至可能导致一部分活性成分分解为其他化学物质（鼠尾草酸转变为鼠尾草酚）。这说明温度并不是影响这3种活性单体含量的唯一因素[15]，溶解性的影响则更明显。鼠尾草酸、鼠尾草酚和熊果酸在葵花籽油中的溶解性比在正己烷中好。这3种单体在Ab-us中的含量均高于Ab-o和Ab-cv，说明超声波的加入能够大大提高鼠尾草酸、鼠尾草酚和熊果酸在迷迭香净油中的含量。此外，迷迭香酸是水溶性酸，在Ab-cv和Ab-o中均未检出迷迭香酸，仅在Ab-us中检出0.18 mg/g，说明像超声波这样对植物细胞有强大破坏作用的提取方式能够促进一些水溶性成分的溶出。

2.5迷迭香净油抗氧化活性分析

BHT、迷迭香净油和葵花籽油乙醇萃取物在不同浓度下对DPPH·的清除作用如图3所示。可以看出，BHT、Ab-cv、Ab-o和Ab-us在0～120 μg/mL浓度范围内，均对DPPH·有显著的清除作用，并且该作用与样品浓度呈明显的剂量-效应关系。但是葵花籽油乙醇萃取物对DPPH·的清除作用表现得不明显，说明葵花籽油作为溶剂在经过乙醇萃取等后续工艺后不存在残留，且对迷迭香净油的抗氧化性没有影响。在该试验中，BHT在较低浓度下便对DPPH·表现出明显的清除作用。但随着样品浓度的增加，BHT与迷迭香净油之间的差异也越来越小。当浓度为120 μg/mL时，BHT、Ab-cv、Ab-o和Ab-us对DPPH·的清除率分别为（89.56±0.358）%、（79.92±0502）%、（75.78±0.633）%和（88.81±1.022）%，所有样品的IC50分别为33.24 μg/mL（BHT）、72.36 μg/mL（Ab-cv）、84.77 μg/mL（Ab-o）和70.07 μg/mL（Ab-us）。在浓度超过120 μg/mL后Ab-us对DPPH·的清除率与BHT相差无几。虽然BHT在浓度不高时对DPPH·的清除作用比迷迭香净油强，但事实上BHT对人体安全存在一定隐患，当剂量达到一定程度后具有溶血和致癌的作用[16]。而迷迭香净油具有天然、安全、抗氧化活性强的特点，尤其是Ab-us是具有开发潜力的食品抗氧化剂。

2.6迷迭香净油贮藏期分析

Ab-cv、Ab-o和Ab-us的总酚含量随贮藏时间的变化如图4所示。由图4可知，Ab-us在12个月的贮藏过程中，总酚含量均高于Ab-cv和Ab-o。在贮藏1个月后，Ab-o中的总酚含量下降了1508%，Ab-cv和Ab-us的下降幅度分别为6.11%和093%。随着贮藏时间的延长，Ab-cv中的总酚含量呈明显快速的下降趋势，幅度大于Ab-o和Ab-us，而Ab-us的总酚含量的降幅低于Ab-cv和Ab-o，说明Ab-us在贮藏条件下更稳定。

3结论

回流提取法和超声油提法制备的迷迭香净油在感官和得率等指标上相近，所得迷迭香净油品质更佳。

迷迭香净油中含有多种芳香成分和VE，随着提取方法不同，含量也不同。超声油提法能丰富迷迭香净油的组成成分，提高VE含量。同时，也能提高抗氧化单体的含量，表现出更好的体外抗氧化活性。而单纯使用葵花籽油进行提取，并不能得到品质良好的迷迭香净油，不论是得率、组成成分还是抗氧化活性都不及回流提取法和超声油提法。因此，若从环保角度出发，使用食用油作为提取溶剂则必须外加辅助手段。

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