合欢树内生细菌HHY—3的生防作用研究

赵秀芳

[摘 要]本试验通过对分离自合欢树叶片中的一株内生细菌HHY-3的生防作用进行了初步研究。通过对峙培养测定了该细菌对5种病原真菌的抑制作用；利用其发酵液进行了合欢枯萎病的防治。结果显示：该菌对苹果树腐烂病菌、梨黑星病菌、合欢枯萎病菌有较好的抑制作用，抑制率分别为75.2%、70.3%和68.5%，而对银杏褐斑病菌、珍珠梅叶枯病菌的抑制率只为43.8%和35.6%。3种不同接种方法对合欢枯萎病的防治效果不同，其中同时接种防治效果最好为70.1%。

[关键词]合欢树；内生细菌；抑制作用；防效

[中图分类号]S641.2 [文献标识码]A

银合欢（ Albizzia julibrissin ） 又称绒花树等，属豆科类植物，在我国华北地区、黄河流域及华南各地均有广泛种植，另外在朝鲜、越南、印度、日本等亚洲地区也有分布，且合欢品种资源非常丰富。合欢不仅在绿化园林中运用广泛，作为行道树美化环境；而且它在原材料和中医药中也有很高的经济价值。目前，人们在对合欢防治病害的研究中主要是对其组织内的有机化合物的分离、纯化和鉴定。Han等对合欢汁液进行提取和初步鉴定，发现它含有20余种化合物，包括甾醇、苷黄酮类化合物、有机酸、神经酰胺及苷等多种活性物质，在中药药理中具有抗过敏、抗氧化、抗癌、抗炎、杀菌、增加免疫力等多种作用。如合欢叶组织的提取物可以很好地预防黄瓜霜霉病（Pseudoperonospora cubensis）；合欢粗提物对根结线虫（Meloidogyne spp）有较强的抑制作用；此外还可以防治油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）；合欢茎叶含有的有效物质对腐烂病菌（Valsa mali）、炭疽病菌（Colletotrichum capsici）均有一定程度的抑制作用效果，說明合欢组织里存在许多抑菌活性物质，而且抑菌谱较广。而关于从合欢组织中分离内生菌进行病害防治的研究鲜为报道。

目前已经证实内生细菌广泛存在于健康植物体内，可以提高植物抗逆能力，改善系统生态平衡；具有多种特性，使之成为植物微生态系统中的重要组成部分；同时内生细菌还是良好的外源基因载体，为抗病、杀虫和固氮等外源基因导入植物体内提供了新的途径和方法。当前植物内生菌的研究在深度及广度上都有很大进展，对于植物内生菌植物资源的研究更是宽泛，从作物、果蔬到中草药、野生植物等。说明我国植物资源分布广泛，植物内生菌资源种类丰富。本试验根据合欢的药用性及较强的环境适应性和抗病能力，以内生细菌的研究技术为基础，对合欢的内生细菌进行生防研究，以期为园林及药用植物内生细菌开发利用、生防机制的研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株

合欢树内生细菌HHY-3，分离于山西农业大学校园里的合欢树叶片，4℃保存，菌体存放在50%的甘油中可于-20℃长期保存。

苹果腐烂病菌（Valsa mali ）、梨黑星病菌（Venturia piritna）、合欢枯萎病菌（Fusarium oxysporwm schl.f.sp.perndiosium）、珍珠梅褐斑病菌（ Sorbaria sorbifolia）、银杏叶枯病菌（Alternaria alternata）以上菌株均由山西农业大学化保实验室提供。

1.1.2 供试合欢种子

合欢为品种银合欢（Leucaena leucocephala）（星河双叶种业）。

1.1.3 供试培养基

NA培养基和PDA培养基的制作参照方中达所述方法。

1.2 使用方法及步骤

1.2.1 菌种活化及发酵液的制备

将HHY-3菌种从4℃冰箱取出，用灭菌的挑针挑取单菌落，在新的LB培养基上划线，放于37℃培养箱中培养2-3 d即可。

将合欢枯萎病菌等5种病原菌用直径为4mm打孔器，打成菌饼，将菌饼接入到新的PDA培养基中，5 d待用。

将活化后HHY-3菌株，用打孔器在细菌生长旺盛的地方打孔，用接种针挑取良好的菌饼，放置于NA培养基里，每6块菌饼放置在一个三角瓶（含50 mL液体NA）中，放在30℃摇床中，在160 r/s条件下，发酵培养7 d。通过三层纱布过滤发醇液，去掉菌丝，过滤后的液体用小孔径纤维素膜抽滤，得到细菌的无菌发酵液。

1.2.2 合欢种植

将合欢种子在0.3%甲醛溶液中浸泡15 min，用清水洗净，用80℃热水浸泡30 min。种植含有基质的育苗钵中（每个小钵边长为5 cm），放到室温下（20-30℃）生长，根据生长情况补充水分。

1.2.3 细菌的对峙抑制试验

菌株采用平板对峙法筛选，对内生细菌进行抑菌测定，计算抑制率。以不接细菌为对照，3次重复。抑制率（%）=（1-处理菌落直径/对照菌落直径）×100。

1.2.4 接种与防治

进行灌根接种，使菌液均匀展布在叶片正反面，罩上塑料棚布，保湿24 -36 h。7-14 d后合欢陆续发病，开始调查病情，然后喷施相关药剂进行防治，以喷施无菌水为对照。分别于14和21 d时

2 结论与讨论

生物农药不仅具有提高作物抗逆性，而且在维持生态平衡方面也有很大的作用。随着国家落实可持续发展战略的进程，加上人们对环境和生态保护的密切关注，生物农药的研究开发越来越受到全社会的重视。我国政府也越来越重视可持续性发展，环境保护生态平衡，生产优质安全的农副产品是必然趋势。微生物农药具有种类多，易控制，能规模化生产等特点，且占生物农药的绝大部分，是生物控制的重要方法。政府对微生物农药的研发政策支持和经费投入都不断加大，使科研人才尖端化设备先进化，科研人员对微生物农药的研究逐渐深入。本试验中，在合欢叶片中分离提取出的内生细菌HHY-3能够抑制多种植物病原真菌。通过盆栽试验表明，内生细菌HHY-3发酵液在一定水平上能够防治合欢枯萎病害。虽然通过盆栽试验证明菌株HHY-3发酵液可以很好地防治合欢枯萎病害，但需要2-3年甚至更多的时间对其进行田间试验来对其防治效果和作用机制做进一步的研究，除此之外，关于该菌株在合欢植株中的寄生能力也需要更进一步研究，以便为该菌株在未来的开发和应用提供更为可靠的理论依据。

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