常用药材中去甲乌药碱的LC—MS/MS测定方法研究

杨明 何思睿 张丹 孙波 王雅一

摘要：该文建立常用药材中去甲乌药碱的LC-MS/Ms测定方法。采用Hypersil Gold-C18柱（100mmx2.1mm，3μm）为色谱柱，流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为甲醇，进行梯度洗脱，流量为0.3mL/min；质谱采用电喷雾电离（ESI+）模式离子化，选择反应监测模式（SRM）扫描。结果表明：去甲乌药碱在3.05～122ng/mL的浓度范围内线性关系良好（y=1 530.85x-153.164，r=0.9993）；检测限和定量限分别为0.6，3ng/mL；重复性精密度和中间精密度分别为4.08%和4.73%；平均加样回收率为86.98%；22种常用中药材中仅有4种药材检测出去甲乌药碱，含量（μg/g）分别为细辛（8.66）>黄柏（8.216）>花椒（5.010）>地肤子（4.66）。所建分析方法可快速、灵敏、准确地定量中药材中去甲乌药碱，并提示部分中药材和食材中存在去甲乌药碱，运动员应慎用。

关键词：去甲乌药碱；Lc-MS/MS；中药材；兴奋剂

0引言

去甲乌药碱（higenamine，HG）属于苄基异喹啉类生物碱，是存在于乌头、附子、莲子心等中药材中的强心活性成分。HG能够刺激B受体，通过减少血小板黏附、抑制iNOS和上调HO-1的表达，对心血管产生正力、正时性作用，增加心输出量和心率，降血压；因此，临床上常被用作强心药。由于近年在運动场上偶有HG阳性发现，为确保运动员健康，世界反兴奋剂机构（world anti-doping agency，WADA）在《2017年禁用清单国际标准》中将HG明确列为β₂：激动剂类禁用物质。然而，HG广泛分布于植物甚至是一些食材中，如减肥产品、能量饮料或运动机能的产品添加剂中常发现有HG的存在嗍，成为运动员误服HG的潜在风险。因此，必须提前避免运动员食用含HG的植物药材或食材。

关于HG的检测文献较少.常用的检测方法有HPLC-UV、法、HPLC-FLD法、HPLC-MS法等。其中常规的HPLC-UV法灵敏度偏低；柱前衍生荧光法，改善了灵敏度，但增加误差步骤：而采用LC-MS法具有灵敏度高、步骤少、选择性高等特点，目前已有用于体内HG的检测。为此，本文拟采用LC-MS/Ms联用技术，在选择反应监测（SRM）模式下，首次对常用中药材和食材中的HG进行定性和定量检测。研究运动员常用药材或食材中HG的分布规律，筛选出适合运动员使用的药材和食材，补充反兴奋剂领域的研究缺陷。

1实验部分

1.1仪器

Ultimate3000 UHPLC高效液相色谱仪（Dionex）-TSQ Quantum Ultra电喷雾三重四级杆质谱仪（Thermo Scientific）；Thcrlno Scientific Hypersil GoldC18色谱柱（100mmx2.1 mm，3μm）；XS205电子分析天平（Mettler Tdedo公司，感量0.01 mg）；KQ-500B超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；5430离心机（德国Eppendorf公司）；200 μL、1000μL移液枪（德国Eppendoff公司）；超纯水制备仪（美国Milli-Q公司）。

1.2试剂与试药

去甲乌药碱对照品（98.4%，LC-MS专用，美国Cato Research Chemicals公司）；药材黄柏、花椒、细辛、地肤子、续断、延胡索、红花、血蝎、赤芍、芙蓉叶、木香、丁香、肉桂、川芎、独活、当归、羌活、大黄、川木香、没药、大血藤、白芷共22味药材，购于中药市场；甲酸（98%，LC-MS专用，百灵威科技有效公司）；甲醇（HPLC grade，Fisher Scientific）。

1.3对照品溶液的配制

准确称取去甲乌药碱对照品适量于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，于4℃下冷藏备用。

1.4供试品溶液的制备

本文以去甲乌药碱含量较高的细辛药材为目标，设计了甲醇浓度、提取时间、浸泡时间、药材粒度等对提取率的考察，最终确定药材的提取条件为：药材粉末（40目）约1.0g，精密称定，于锥形瓶中加入75%甲醇50mL，浸泡1h并超声提取0.5 h，离心15min（5000r/min），取上清液1mL于10mL量瓶中，加75%甲醇溶液至刻度，摇匀，取溶液适量用0.22μm的微孔滤膜过滤，滤液作为供试品溶液用于LC-MS/MS进样。

1.5仪器条件

1）色谱柱：Thermo Hypersil Gold（100mmx2.1mm，3μm）；流动相：A相为0.1%甲酸水溶液，B相为甲醇，梯度洗脱流程见表1：流量：0.3mL/min；柱温：35℃：进样体积：5μL。

2）质谱条件

电喷雾电离源（ESI）；正离子扫描；选择反应监测（SRM）扫描模式；喷雾电压3 500kV；毛细管温度为350℃；氮气作为鞘气和辅助气，其中鞘气压力为35psi（1psi=6.895kPa），辅助气压力为10psi；氩气为碰撞气，碰撞压力为1.5retort（1Ton=133.322Pa）；母离子为m/z=272.2，定量离子为m/z=107.3，对应的碰撞能量为28eV。

在上述条件下，对照品以及样品的总离子流图分别见图1和图2，去甲乌药碱保留时间约为5.56min，其质谱图见图3。

1.6基质考察

取甲醇10mL，超声处理1 h，于5000r/min下离心15min，取上清液1mL于10mL容量瓶中，用50%甲醇定容，取适量用0.22μm的微孔滤膜过滤，用于LC-MS/MS进样，结果说明空白基质对去甲乌药碱的测定无干扰。

2方法学验证

2.1线性与检测限

将1.3项去甲乌药碱标准储备液稀释至一定浓度，再分别取适量于10mL容量瓶中，加甲醇稀释成一定梯度的系列对照品溶液。按照1.5项仪器条件进行测定，以去甲乌药碱浓度为横坐标，以定量离子峰面积积分值为纵坐标进行回归分析，得出在3.05-122 ng/mL浓度范围内去甲乌药碱的线性回归方程为y=l 530.85x-153.164，相关系数r=0.9993。取上述标准梯度中最大浓度溶液，逐级稀释，进样测定，直到信噪比S/N≥3和S/N≥10时，对应的检测限和定量限分别0.6 ng/mL和3 ng/mL。

2.2精密度实验

取一定浓度去甲乌药碱对照品溶液，重复进样6次，记录色谱图，以峰面积计算进样精密度（RSD）为2.56%；分别取细辛药材粉末6份，照1.4项下条件提取制备供试品溶液，进样5μL于LC-MS-MS仪，记录总离子流图色谱图以去甲乌药碱的含量计算重复性精密度（RSD）为4.08%；同时另由两个不同的人员分别连续6d处理并测定细辛中去甲乌药碱的含量，计算中间精密度（RSD）为4.73%，满足试验需要。

2.3稳定性试验

称取细辛药材适量，按照1.4项下制备方法进行处理，并于1.5项下的仪器条件分别在0，1，2，4，8，12，24h进样，记录峰面积，由峰面积计算RSD。结果细辛中去甲乌药碱峰面积变化的RSD值为4.78%，表明去甲乌药碱溶液24 h内具有较好的稳定性。

2.4加样回收率实验

称取细辛药材约1 g（本底值8.66 μg/g），分别加入3个不同水平的去甲乌药碱对照溶液，按照1.4项下制备方法进行处理，并于1.5项下的仪器条件测得加样回收率如表2所示。

2.5样品测定

分别取黄柏、花椒、细辛等22种常用伤痛药材细粉各1.0g，精密称定，于锥形瓶中加入75%甲醇50mL，浸泡1h并超声提取0.5h，离心15min（5000r/min），取上清液1 mL于10mL量瓶中，加75%甲醇溶液至刻度，摇匀，取溶液适量用0.22txm的微孔滤膜过滤，滤液作为供试品溶液，结果如表3所示。

3分析与讨论

3.1供试品溶液的制备

由表4可知，甲醇的体积分数在75%时效率最高：由表5可知，提取剂的用量升高与提取率正相关，其中1：50后提取率上升不明显，确定1：50（g/mL）的比例较为适宜：实验还表明药材粒度小有利于提高效率，确定40目较为适宜。由图4可知，提取效率与超声时间正相关：图5和图6表明，提取效率与预先浸泡时间正相关，比较不同时间浸泡时间后0.5 h和1 h的超声提取可知，在相同浸泡时间的条件下，超声时间越长，提取率越高。所以，综合考虑充分浸泡和缩短超声时间的条件下，确定浸取1h再超声0.5h。另外，实验发现直接甲醇稀释的供试品溶液进样后，去甲乌药碱的峰行展宽明显，而选用50%甲醇溶液稀释进样柱效明显改善。

3.2 HG与运动员

HG作为β₂激动剂类物质，已被列入WADA的兴奋剂清单中，其心脏方面正时性、加快心率等作用将直接影响高强度运动员的身体健康，需要提前预防运动员误食误用含HG的食材或药材。本文针对中药铁打损伤药和火锅等食材和药材，选用了处方中常用的细辛、木香、芍药、川芎、地肤子、红花、黄柏、花椒等22种材料，并在黄柏、花椒、细辛和地肤子中定量检出HG，证明了中药和食材中可能造成远动员的误用。特别是火锅中传统放入大量花椒，是食材中最容易摄入过量HG的途径。另一方面，结合HG的人体药代动力学的特征，其半衰期短（t₀₅为0.133 h约7.98 min），消除快（CL為249 L/h）且主要通过尿排泄，所以，当运动员赛前误食过多的含去甲乌药碱食物，建议大量饮水加快排泄。

4结束语

综上，本文所建常用药材中去甲乌药碱的检测方法，具有快速、灵敏、精准等特点，是常用药材中HG检测的较好方法。其中地肤子、花椒、黄柏等药材属本文首次定量报道。在所选的22种常用药材和食材中有4种药材检出HG，将提示WADA和运动员以及心血管患者需特别慎用。