化妆品菌落总数计数检测能力验证结果与分析

刘恩思 张丽娜 刘美秀 蒋玲

[摘要] 为提高实验室检测能力，增强实验室竞争力。2017年参加中国食品药品检定研究院组织的化妆品中菌落总数计数检测能力验证（NIFDC-PT-126）。依据检测能力验证作业指导书和国家标准《化妆品安全技术规范》（2015年版），对样品进行化妆品中菌落总数计数检测，高浓度样品结果不滿意，低浓度样品结果满意。对这次能力验证过程进行分析和总结，希望可以规范实验室以后的能力验证活动。

[关键词] 能力验证；菌落总数计数；化妆品

[中图分类号] R446 [文献标识码] A [文章编号] 1672-5654（2018）07（b）-0147-02

能力验证是利用实验室间比对，按照预先制定的准则评价参加者的能力[1]。实验室间比对是按照预先规定的条件，由两个或多个实验室对相同或类似的物品进行测量或检测的组织、实施和评价[1]。实验室可以通过参加并利用能力验证这种外部质量保证工具，识别与其他实验室之间的差异，监督和改进自身检测能力，对所用方法及仪器进行确认，结合实验室的内部质控，为自身的持续改进和完善质量管理体系提供信息。2017年该实验室参加由中国食品药品检定研究院组织和实施的化妆品菌落总数计数检测能力验证，高浓度样品结果不满意，低浓度样品结果满意。这是该实验室首次参加微生物检测项目的能力验证，对这次能力验证过程进行分析和总结，希望可以规范该实验室以后的能力验证活动。

1 资料与方法

1.1 材料

能力验证样品来自NIFDC-PT-126化妆品菌落总数计数检测，共2份样品，代码分别为0117、0120，每份样品为西林瓶装的白色菌球及膏状粉底，1 g/瓶，样品保藏温度为-20℃，由中国食品药品检定研究院提供。

1.2 仪器与试剂

SPX-150型生化培养箱、LT502型电子天平、LMQ.C型立式灭菌器 、GD65-1型鼓风干燥箱、一次性使用培养皿（生产日期2017.10.29，灭菌有效期2年）、卵磷脂吐温80营养琼脂培养基（批号： 20170925）。

1.3 方法

按照NIFDC-PT-126化妆品中菌落总数计数检验作业指导书和《化妆品安全技术规范》（2015年版）[1]的要求进行样品稀释、注皿、培养、计数。

1.3.1 稀释样品 获得样品后，待其恢复至室温，再开启西林瓶。分别在每个西林瓶中加入5 mL 灭菌生理盐水，将样品完全溶解并充分混匀，转移到灭菌的刻度试管中，然后在用灭菌生理盐水洗西林瓶3次，1 mL/次，最后定容至10 mL，制成1：10的稀释液检液。用移液器吸取1：10的稀释液1 mL沿管壁注入盛有9 mL灭菌生理盐水的无菌试管中，涡旋振荡使其充分混匀，作为1：100的稀释液；按上述操作方法制备10-3至10-10稀释液。操作各环节应保证无菌和充分混匀。

1.3.2 测定菌落总数 卵磷脂吐温80营养琼脂培养基水浴保温，保证温度大约为45℃。从2.1中制备的1∶10 至10-10稀释液中，每个稀释度分别各取出1 mL加入到2个无菌平皿中，每皿加入约15 mL卵磷脂吐温80营养琼脂培养基，摇匀，待培养基凝固后倒置放入培养箱，培养温度为36℃。 培养24 h后计数1次，48 h后再次计数。同时以培养基做空白对照。

2 结果

取2个平皿读数的平均值作为最终结果。样品0171，计数结果为130 000 CFU/g。样品0120，计数结果为170 000 CFU/g。见表1。

3 分析与讨论

NIFDC-PT-126化妆品菌落总数计数检测能力验证计划为定量检测项目，设计了2个不同浓度的样品，有一定难度。该实验室高浓度样品结果不满意，低浓度样品结果满意，且两项结果均低于指定值。初步分析原因可能是：①防腐剂未全部中和。《化妆品安全技术规范》（2015年版）[2]规定化妆品中可以添加防腐剂来抑制微生物的生长，允许使用的化妆品防腐剂达到51种；同时在菌落总数检验方法中规定在培养基中加入卵磷脂和吐温80来中和化妆品中的防腐剂。但是实验中防腐剂和其他抑菌成分是否被有效中和没有相应的判定方法。②样品溶液过于浓稠，稀释后的样品可能未完全溶解或混匀不充分。根据以往的经验，样品过于浓稠和菌落总数结果太高时，采用培养基稀释法利于菌落的生长和计数，可以获得较准确的结果。③该次实验方案有疏漏之处，没有设计人员比对和稀释液（灭菌生理盐水）对照，无法排除人员操作和稀释液对结果的影响。

实验过程中有几个操作要点需要注意：①样品要全部使用完，稀释度至少做到10-10，确保有适宜计数的平板。②在培养皿中加入样品溶液后，尽快倒入45℃的培养基，并混匀。防止培养皿吸附细菌并成片生长无法计数。③平板培养24 h后计数一次，防止菌落蔓延，培养48 h无法计数。④TTC也是一种抑菌剂，会抑制部分细菌生长，由于此次项目为菌落计数，且经涡旋振荡处理的检液中几乎无颗粒，在实验时未加入TTC。但由于缺乏实验数据支持，这样操作可能导致结果不准确，在今后的实验中考虑用加了TTC的对照组来比较计数结果，再综合判定选择以哪个计数结果报告。⑤为了尽量减少人员操作对结果的影响，除样品稀释外，全过程可以设计双人同时实验。也可以在实验过程中设置观察员，监督实验操作。双人实验时要统一菌落计数的标准，避免人为误差。对于同一平板，两人计数结果相对标准偏差在10%以内时，可以判断为结果一致。

《化妆品安全技术规范》（2015年版[2]中的微生物检验方法均未明确要进行方法学验证，但结合以往的药品微生物检验经验，如果不能有效去除样品中的抑菌成分，会造成菌落计数结果偏低，致病菌检测“假阴性”结果。可以参照《非无菌产品微生物限度检查微生物计数法》《非无菌产品微生物限度检查控制菌检查法》[3]进行方法学研究，选择适宜的敏感菌株，采用常规法、培养基稀释法及薄膜过滤法等不同的样品处理方法，有效去除化妆品中防腐剂和其他抑菌成分的影响。测定敏感菌株的回收率达到50%以上，认为供试液制备方法、抑菌成分的消除方法经上述方法学验证可以确保实验结果准确，提高实验的阳性结果检出率[4]。对于抑菌作用较强的供试品，在供试品溶液性状允许的情况下，应尽量选用薄膜过滤法进行试验。

《化妆品安全技术规范》（2015年版）[2]中的微生物检验方法没有规定对实验材料（培养基和试剂）的质量要求。可以参照《非无菌产品微生物限度检查微生物计数法》《非无菌产品微生物限度检查控制菌检查法》[3]和《食品安全国家标准 食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要求》[5]对使用的培养基进行适用性和灵敏性检查，确定实验结果较准确的实验材料品牌和批号用于能力验证实验使用。

能力验证实验前应该多做几次预实验，特别是采购质控样做预实验，用以验证该实验室使用的各项实验材料，优化实验方案。在方法学验证资料和预实验基础上，建立该项目的能力验证SOP，确保能力验证的实验方案科学严谨，得到准确和满意的结果。

希望该实验室通过各项实验数据的累积，逐步建立各检验项目的能力验证SOP；通过不断参加能力验证活动，持续提升自身的技术能力。

[参考文献]

[1] 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.GB 27043—2012 合格评定 能力验证的通用要求[S].北京：中国标准出版社，2013.

[2] 国家食品药品监督管理总局.化妆品安全技术规范（2015年版）[S].北京：中国标准出版社，2016：469-473.

[3] 国家药典委员会.中华人民共和国药典2015年版[S].北京：中国医药科技出版社，2015：140-149.

[4] 陈磊，闵红，卢军.美容修饰类化妆品微生物检查方法学研究[J].中国卫生检验杂志，2015，25（18）：3087-3090.

[5] 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.GB 4789.28—2013 食品安全国家标准 食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要求[S].北京：中国标准出版社，2014.

（收稿日期：2018-04-15）