猕猴桃青霉病病原菌鉴定及中草药提取物对其抑菌效果

程小梅　彭亚军　杨玉　徐海　罗赛男　卜范文

摘要

为了解决猕猴桃真菌病害导致的贮运难题，作者从湖南、陕西两个猕猴桃主产区采集的病果中分离获得青霉菌株Q1，应用 rDNAITS 分子标记、BLASTn比对，结合传统真菌形态学鉴定，确定该致病菌为草酸青霉Pencillium oxalicum。利用带药培养基法筛选出对侵染猕猴桃的青霉菌有最佳抑制作用的中草药提取物，猕猴桃果实采后刺伤接种Q1，研究中草药提取物对果实病斑直径的影响。结果表明：川芎、肉桂、高良姜的乙醇提取物对青霉均有较好的抑制效果，菌丝生长相对抑制率分别达到92.79%、77.67%、78.49%，其中以川芎的抑菌效果最佳。猕猴桃果实在贮藏期接种Q1菌株后，中草药提取物处理可显著抑制果实病斑扩大。

关键词

猕猴桃； 青霉； 鉴定； 中草药提取物

中图分类号：

S436.634

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017282

Identification of the pathogen causing fruit penicilliosis on kiwifruit and the

inhibition effect of Chinese herb extracts on the pathogen

CHENG Xiaomei1，2， PENG Yajun3， YANG Yu1，2， XU Hai1，2， LUO Sainan1，2， BU Fanwen1，2

（1. Hunan Horticultural Research Institute， Hunan Academy of Agricultural Sciences， Changsha 410125， China；

2. Scientific Observation and Experiment Station of Fruit Trees in Central China， Ministry of

Agriculture， Changsha 410125， China； 3. Institute of Plant Protection， Hunan Academy of

Agricultural Sciences， Changsha 410125， China）

Abstract

The aim of this study is to solve the difficulties of fungal diseases in postharvest storage and transit of kiwifruit. The pathogen of kiwi penicilliosis was isolated from the diseased kiwifruit collected from main production areas of Hunan and Shaanxi provinces and was named Q1. Based on rDNAITS sequence analysis， BLASTn alignment and traditional morphological identification， the pathogen was identified as Pencillium oxalicum. The Chinese herb extracts with the best inhibiting effects to Pencillium oxalicum were screened by drugcontaining PDA plates， and their effects on controlling disease of kiwifruit inoculated with P.oxalicum were also investigated. The results showed that ethanol extracts of rhizoma ligusticum wallichii， cinnamon and galangal all had good inhibiting effects on P.oxalicum， with the inhibition ratio of 92.79%， 77.67%， and 78.49% on mycelial growth， respectively， among which extract of rhizoma ligustici wallichii had the best antifungal activity. During kiwifruit storage， Chinese herb extracts treatment significantly decreased the lesion diameter of kiwifruit inoculated with P.oxalicum.

Key words

kiwifruit； Penicillium； identification； Chinese herb extract

獼猴桃是一种深受消费者喜爱的水果，营养极为丰富。维生素C含量高，同时还含大量的糖、蛋白质、氨基酸等多种有机物和人体必需的多种矿物质。猕猴桃果实青霉病是我国猕猴桃贮藏期的主要病害，在湖南、陕西等猕猴桃主产区发生比较普遍，症状为在果面受损伤处呈现青绿色霉层，易于识别。病原为多种青霉，主要由伤口侵入，引起腐烂。青霉不仅引起猕猴桃腐烂，还危害柑橘、苹果、梨、哈密瓜等的叶片和果实，引起各种贮藏病害[12]。常用于水果贮藏保鲜的抗真菌作用较强的中草药成分主要有丁香、木香、大黄、荆芥、肉桂、茵陈蒿、川芎、肉豆蔻、黄连、黄芩、紫草和黄柏等[37]。本研究从湖南、陕西两大猕猴桃主产区采集了青霉危害的样本，对该病菌的致病力、形态学、分子生物学特性进行比较分析，同时筛选出对分离菌株有较强抑菌作用的中草药提取物，以期为猕猴桃贮藏期真菌病害的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

猕猴桃青霉病病果采自湖南永顺、凤凰，陕西眉县、周至4个猕猴桃主产区的5个果园，每个果园分别采集样品6份，共计30份。

马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：马铃薯 200 g、葡萄糖 20 g、琼脂20 g、蒸馏水 1 L。

试剂及仪器：PCR 扩增仪为TaKaRa Bio Inc.生产的 TaKaRa Thermal Cycler DiceTP600；核酸电泳仪为ADVANCEBIO Co.， Ltd生产的Mupid；蛋白质电泳仪为上海天能生产的EPS300；电泳成像装置采用Pharmacia Biotech ImageMaster VDS；DNA测序仪为Applied Biosystem生产的ABI PRISM TM 3730XL DNA Sequencer；循环测序试剂盒采用BigDye Terminator V 3.1 Cycle Sequencing Kit；川芎、肉桂、高良姜原料均购于安徽蜀中医药有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分离纯化、致病性测定及柯赫氏法则验证

将发病的果实表皮用清水清洗干净，切取5 mm×5 mm的病组织数块，用75%的乙醇消毒10 s，随后放入0.1%升汞消毒5 min，取出后用无菌水冲洗3次，将病组织放入马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）平板中，在28℃黑暗培养，分离纯化得到供试菌株。将分离纯化的菌株在PDA平板上28℃培养3～5 d后用打孔器打取直径4 mm的菌丝块。每个处理选取健康的猕猴桃果实10个，用接种针在果实腰部将果实刺伤后将菌饼有菌丝的一面紧贴于果实伤口处，菌丝块表面覆盖湿棉球，放入瓷盘中密封保湿，逐日观察各处理的发病情况。以接种不含菌PDA为对照。从接种后发病的果实上再次分离、纯化和培养病原菌，并与原菌株进行比较。

1.2.2 病原菌的形态学观察

将菌株接种到PDA平板上于培养箱中28℃避光培养2 d，在显微镜下观察病原菌的分生孢子形态。

1.2.3 病原菌的分子生物学鉴定

从PDA平板上用牙签挑取少量菌体于50 μL裂解缓冲液（TaKaRa Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR， Code No. 9164）中，在80℃下，变性15 min，变性后离心取上清作为模板。使用TaKaRa Fungi Identification PCR Kit（Code No. RR178）扩增目的片段。PCR反应体系为50 μL，其中，DNA模板（变性反应液）1 μL，PCR Premix 25 μL，ITS Forward primer （20 pmol/μL） 0.5 μL，ITS Reverse primer （20 pmol/μL） 0.5 μL，ddH2O 23 μL。扩增程序为：94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，30个循环；72℃ 5 min；扩增完毕，取10 μL扩增产物用1.2%琼脂糖凝胶进行电泳检测[8]。PCR产物送宝生物工程（大连）有限公司测序。将所得的序列提交到GenBank核酸序列数据库中，获得登录号。同时将序列作同源相似性差异分析，确定该菌株的分类地位，用NJ法（neighborjoining method）构建系统进化树。

1.2.4 中草药提取物对青霉的抑菌作用

精选川芎、高良姜、肉桂原料切碎后，取肉桂粗粉各10 g。分别以乙醇为溶剂，索氏法提取3.2 h，提取液过滤，减压回收乙醇至无醇味，热水分散后放冷，石油醚（60～90℃）脱脂3次，水液浓缩，80℃干燥成干浸膏，粉碎成细粉供试[9]。分别配制肉桂、高良姜、川芎提取液母液330 mg/mL备用。取配制好的中草药提取液母液与PDA培养基混合均匀制成浓度为8.25 mg/mL的带药培养基，将其倒入9 cm培养皿中，以相同量的无菌水代替中草药母液作为对照[10]。提取物对青霉的抑菌效果采用改良的菌丝生长速率法[1113]，即在含药培养基中央用直径为4 mm的打孔器打孔，注入50 μL 1.0× 106个/mL的青霉孢子悬浮液，培养箱28℃培养72 h后观察试验结果。采用十字交叉法测量各菌落直径，计算各处理菌落直径的平均值和菌丝生长相对抑菌率。

抑菌率=ck-cck×100%；

公式中ck为对照组菌落的净生长量，c为中草药处理组菌落的净生长量。

1.2.5 中草药提取物对猕猴桃果实损伤接种青霉的抑菌效果

选取外观整齐、无病虫害和机械损伤的猕猴桃用75%乙醇消毒，晾干备用。用接种针在果实表面穿刺接种，对照组只接种Q1病原菌，处理组先接种孢子浓度为106～107个/mL的青霉孢子悬浮液50 μL，稍晾干后接种中草药提取物处理液，同时设有空白对照。伤口晾干后将果实放在包装盒中，外套塑料袋保湿，于26℃贮藏。每隔2 d观察发病率和病斑直径。持续观察7 d。每个处理设3次重复，每重复8个果实，果实损伤接种后病斑直径测量采用十字交叉法[14]。

2 结果与分析

2.1 猕猴桃青霉病病原菌的筛选分离及致病性测定

从30份样品中共分离到6株具有较强致病性的青霉，健康猕猴桃接种这6株青霉后，其发病症状与自然发病症状一致，所有对照均无发病症状。对接种后发病的组织进行再次分离均能得到与原来接种的菌落特征相同的分离物[15]。后续试验取菌株Q1进行。

2.2 猕猴桃果实上分离青霉的形态学特征

如图2a所示，菌株Q1在PDA培养基上的菌落为暗青色，粉粒状，生长速度较快，边缘呈白色。从背面观察培养基，发现培养基由浅黄色慢慢變为黄褐色，并随着培养时间的延长而逐渐加深。分生孢子呈念珠状串生，单孢无色，近球形（图2b）。

t

2.3 猕猴桃果实上分离青霉的分子生物学鉴定

将菌株Q1的ITS基因序列提交至GenBank，获得登录号MF669724。病原菌的琼脂糖凝胶电泳结果见图3。菌株Q1和菌株L1为作者从猕猴桃感病果实中分离出的具有代表性的菌株。将所得序列作同源相似性分析，确定了该菌株的分类地位，构建了系统进化树，结果（图4）表明，菌株Q1与登录号KP735935.1和登录号KX674635.1的同源性最高，综合比较病原菌的形态学特征结合序列比对结果可以得出，菌株Q1为草酸青霉Penicillium oxalicum[16]。

2.4 几种中草药提取物对青霉的抑菌情况

表1結果可以看出肉桂、高良姜和川芎提取物均对Q1的抑菌效果良好，尤其是川芎提取物对Q1的抑菌率最高，达到了92.79%。

2.5 中草药提取物对猕猴桃果实采后刺伤接种Q1的病斑直径的影响

猕猴桃果实接种Q1菌株4 d后，病斑直径不断增加，但中草药提取物处理显著抑制了果实病斑的扩大（图5）。综合比较川芎、高良姜、肉桂三种提取物的处理结果，川芎提取物的抑制效果最突出，高良姜提取物其次，最后为肉桂提取物。

3 结论与讨论

中草药提取物具有良好的杀菌作用，对人体和环境无危害，增加了水果食用的安全性，用于水果保鲜有很好的效果。将中草药提取物应用到食品防腐的最大优点就是腐烂率低，很少甚至不影响食品的原有风味。同化学合成的防腐剂相比，中草药提取物不仅无毒，对人体健康也有裨益。再者，中草药简单易得、取材容易、经济实惠，中草药提取物替代化学合成保鲜剂用于水果贮藏保鲜有着广阔的发展前景。本研究对猕猴桃青霉病病原菌进行了筛选、鉴定，应用 rDNAITS 分子标记分析、BLASTn比对，结合传统真菌形态学鉴定，确定致病菌Q1为草酸青霉Pencillium oxalicum。作者从众多中草药提取物中筛选出川芎、高良姜、肉桂三种中草药提取物对猕猴桃青霉病病原菌抑菌效果较好，将三种抑菌效果较好的中草药提取物用于猕猴桃果实采后刺伤接种青霉的防腐，发现对病斑直径的扩大仍有较好的抑制作用。在后续的试验中作者会进一步验证在本试验中发挥抑菌作用的几种中草药提取物的主要抑菌成分，力争将本试验结果可以直接应用于生产实践、解决猕猴桃贮运难题。

参考文献

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