甘蓝抗软腐病离体鉴定方法探究

马燕勤 李勤菲 司军

摘要 通过分析不同因素对甘蓝软腐病离体接种后发病效率的影响，建立了一套甘蓝软腐病抗性的快速鉴定方法。结果发现，用浓度为6.4×10.8 cfu/mL的软腐病液体培养基悬浮液，采用针刺法接种苗龄为5～7叶期植株的离体叶片，接种后空气湿度为90%以上是最有利于软腐病发病的方法。利用该方法鉴定27份栽培甘蓝，发现高抗材料3份，抗病材料8份，耐病材料8份，感病材料8份。

关键词 甘蓝； 软腐病； 离体抗性鉴定

中图分类号： S 436.33

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017460

Abstract A multifactor experiment with three duplicates was established to investigate three different inoculation techniques （transaction inoculation， injection and pin prick） by using pathogenic isolates ofPectobacterium carotovorumsubsp.carotovorum in China against resistant and susceptible cabbage cultivars under controlled greenhouse conditions. It was found that the method with the pathogen suspended in the liquid NA medium at the density of 6.4×10.8cfu/mL， inoculating plants at the seedling age of 5-7-leaf old by pin prick in the growth chamber with a high moisture of over 90%， was suitable for the pathogen to infect the cabbage leaves. This method was used to identify resistance to soft rot in 27 cabbage cultivars， three of which showed high resistance， eight moderate resistance， eight tolerance and eight susceptibility to soft rot.

Key words cabbage； soft rot； resistance identification

甘蓝软腐病，又称水烂、烂疙瘩，是甘蓝包心后期的主要病害之一，可使甘蓝严重减产，甚至绝收，而且在收获、运输、储藏、销售等过程中还可继续腐烂，造成极大损失[1]。病害从伤口部开始发生，初期呈现浸润状半透明，以后病部逐渐扩展成明显的水溃状，表皮下陷，有污白色细菌溢脓，并散发出恶臭。重病植株的叶柄基部和根茎处组织完全腐烂，病株变得一踢即倒，一拎即起[2]。植物细菌性软腐病的主要致病菌为果胶杆菌Pectobacterium spp.。该菌可侵染至少16种双子叶植物和11种单子叶被子植物[3]。该属目前被划分成4个种，P.carotovorum（Pc），P.atrosepticum （Pa），P.betavasculorum（Pb）和P.wasabiae（Pw）[4]。与后三个种相比，Pc表现出高度多样性[5]，可进一步描述为3个亚种：P.c.subsp.carotovorum（Pcc），P.c.subsp.odoriferum（Pco）和P.c.subsp.brasilience（Pcb）[6]。

Pcc是自然条件下普遍存在的、寄主范围和地理分布最为广泛的植物病原菌[7]，能侵染温带和亚热带种植的马铃薯、白菜、甘蓝等数百种蔬菜和某些花卉植物[8-9]，2011年马来西亚学者报道称甘蓝软腐病的致病病原菌为Pcc[10]。甘蓝Brassica oleracea L.作为一种主要的蔬菜作物在我国各地广泛栽培，近年来随着国内周年供应需求及出口贸易的增加，甘蓝种植面积逐年扩大，现已达到了每年90万hm.2，成为占据国内市场主导地位的蔬菜之一。对软腐病的防治有多种方法，例如生物学方法防治，有报道称乳酸菌[11]能有效防治田间软腐病；物理防治，如γ射线[12]；而培育和选育抗病品种也是防治植物病害的重要措施，植物品种抗病性的鉴定是抗病育种的一项关键技术。

本试验参考大白菜软腐病抗性鉴定方法[13-15]，通过对现有甘蓝种质资源的抗性进行苗期室内鉴定探究，旨在找到一种快速简单的甘蓝软腐病抗性鑒定方法，并对甘蓝资源材料进行初步鉴定，为甘蓝抗软腐病综合育种工作奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试菌株：Pectobacterium carotovorumsubsp.carotovorum（Pcc），采购于中国微生物官网。

供试品种：由西南大学十字花科蔬菜研究室提供的有明显抗性差异的3个材料R1、R2和R3，以及该实验室种质资源圃自交系稳定的24份材料。

1.2 试验方法

1.2.1 甘蓝育苗

育苗工作在封闭完好的防虫玻璃温室内进行。使用高温灭菌的营养土及4孔×8孔的穴盘育苗，选择充实饱满、发芽势一致的种子，每穴2粒，覆土厚度0.8～1.0 cm。每个材料育30株，苗龄在5～6叶期时接种。

1.2.2 菌悬液的制备

在苗期抗性鉴定前2 d，用NA液体培养基制备菌悬液，菌悬液放在28℃的摇床上培养24 h，采用血球计数板计数[16]，根据各试验的需要分别配制为含菌量6.4×10.7、6.4×10.8、6.4×10.9 cfu/mL的菌悬液，供接种鉴定用。

1.2.3 最佳接种湿度的确定

采用针刺法研究接种后不同湿度对甘蓝软腐病的影响。甘蓝品种为‘京丰一号。在甘蓝苗龄为 5～6叶期时取健康外叶，每个处理采摘10株，每株采摘3片叶，用流水冲洗1 min，然后用75%的乙醇溶液处理30 s，再用无菌水漂洗3遍，将处理后的离体甘蓝叶片排入 20 cm×15 cm×6 cm的塑料盒中，用大小相同的针10根捆成一束在离体叶片的叶脉基部针刺，用移液管或枪吸取10 μL浓度为6.4×10.9cfu/mL的菌悬液缓慢地注入伤口表面，接种后置于空气湿度分别为50%～60%、70%～80%、90%～100%的条件下，72 h后调查、记录发病程度。

1.2.4 接种苗龄、方法和接种液的确定

以R2为材料，采用L9（3.4）正交设计[17-18]。分别设置接种苗龄、接种方法和接种液3个因素，每个因素设置3个水平（表1），试验重复3次。接种用菌悬液浓度为64×10.9cfu/mL。

1.2.5 最佳接种浓度的确定

将Pcc菌悬液配制成6.4×10.7、6.4×10.8、6.4×10.9cfu/mL 3个不同浓度的菌悬液，利用筛选出的苗期人工离体接种方法、苗龄和接种液，接种3个有抗性差异的材料R1、R2、R3。相对湿度为确定的最佳接种湿度。

1.2.6 病情分级标准的制定

参考大白菜[17-18]和拟南芥[19]软腐病单株分级标准，并根据预试验中甘蓝离体叶片被软腐病病原菌侵染后出现的表型，将病情划分为6个级别。0级：接种点无侵染病症；1级：病斑刚开始形成，呈水浸状；3级：病斑长度<1 cm；5级：1 cm≤病斑长度<2 cm；7级：2 cm≤病斑长度<3 cm；9级：病斑长度≥3 cm或者叶柄大部或全部腐烂。

1.2.7 群体分级标准

分级标准参照“九五”国家攻关组制定的病毒病和霜霉病的群体分级标准。免疫（I）： 病情指数为0.00；高抗（HR）： 0.00<病情指数≤11.11；抗病（R）： 11.11<病情指数≤33.33；耐病（T）： 33.33<病情指數≤55.55；感病（S）： 55.55<病情指数≤77.77；高感（HS）： 77.77<病情指数≤100。

病情指数=100×∑（各级病株数×各级代表值）/（总株数×最高级代表值）。

1.2.8 27份材料的抗性鉴定

根据预试验得出的最佳接种方法对27份现有的甘蓝种质资源进行抗病性鉴定。

2 结果与分析

2.1 甘蓝软腐病离体抗性鉴定方法

2.1.1 不同接种湿度对甘蓝软腐病发病的影响

采用针刺法研究接种后不同湿度对甘蓝软腐病发病的影响。对3个相对湿度下的病情指数进行方差分析，结果表明F值为26.94，F>F0.01=18.00， 因此需要对3个接种湿度做显著差异性分析，结果见表3。

从表中可以看出， 接种湿度在90%～100%时甘蓝软腐病的病情指数最高，极显著高于接种湿度为70%～80%和 50%～60%的病情指数；接种湿度为70%～80%的病情指数显著高于接种湿度为50%～60%的病情指数。由此可以得出：空气相对湿度高有利于甘蓝软腐病的发生。

2.1.2 接种方法、苗龄、接种液对甘蓝软腐病发病的影响

从方差分析来看苗龄（A因素）、接种方法（B因素）的F值分别为12.19和20.62，达到极显著水平，接种液（C因素）的F值为4.48，达到显著水平。从表4还可以看出接种方法较苗龄和接种液而言，影响最大，苗龄次之，接种液的影响最小。由于试验前不能确定三因素间有无明显交互作用，三因素的各水平间无法进行差异比较，因此本试验主要是确定不同处理组合间的差异比较，对组合进行新复极差检验。

从表4可以看出，第9个处理组合（7～8片真叶，针刺法，50%无菌水+50%液体NA培养基菌悬液）和第6个处理组合（5～6片真叶，针刺法，接种液为无菌水菌悬液）的接种效果最好，病情指数累积值分别为222.41和212.33，两者之间没有显著差异；其次在试验中发现NA培养基菌悬液有利于其黏着在甘蓝叶片表面，并且接种液对试验结果影响很小，所以最终选择NA液体培养基菌悬液为最佳接种液。

2.1.3 不同接种浓度对甘蓝软腐病发病的影响

从表5可知，用6.4×10.7 cfu/mL浓度接种后72 h，3个材料均表现为抗性（R），用6.4×10.8 cfu/mL浓度接种后有一个材料表现为抗性（R），两个材料表现为耐病（T），而用6.4×10.9cfu/mL浓度接种后有一个材料表现为耐病（T），两个材料表现为感病（S），虽然从数据上看6.4×10.8cfu/mL的接种浓度未能将不同抗性的材料区分开，但是在试验图片中是可以将三者区分开的（图片未展示），因此认为菌液孢子含量6.4×10.8cfu/mL是最佳接种浓度， 接种后72 h调查最佳。

2.2 甘蓝种质资源抗性鉴定

采用上述方法对 27份西南大学十字花科研究所的甘蓝种质资源进行鉴定。结果筛选出高抗材料3份，抗病材料8份，耐病材料8份，感病材料8份，无免疫和高感材料（表6）。

3 小结与讨论

3.1 小结

通过对接种苗龄、接种方法和接种液进行3因素3水平的正交试验，得出最佳接种苗龄为5～7叶期、最佳接种方法是针刺法、适宜接种液为液体培养基菌悬液，最佳接种浓度为6.4×10.8 cfu/mL，病情指数调查均在接种后72 h，叶片反面接种，接种部位为叶片主脉中部并且接种的最佳保湿条件为空气相对湿度 90%以上。

3.2 接种湿度是离体接种鉴定方法的重要条件

据报道，空气湿度[20-21]是影响大白菜软腐病发生程度的重要条件，本试验发现，甘蓝离体叶片接种后软腐病的发生也需要相对湿度达到较高的水平，只有空气相对湿度保持在90%以上时才能导致软腐病斑的形成。

3.3 接种方法、苗龄和接种液对软腐病发病的影响

在探究接种方法、苗龄和接种液对软腐病发病的影响时本试验采用了正交设计，这样既减少了试验内容，同时也能够对浓度、苗龄和接种方法3个因素同时进行考察。试验表明，用大小相同的针10根捆成一束在离体叶片的叶脉基部针刺法是离体接种软腐病菌的最佳接种方法。试验发现，采用刀片横切法接种，伤口发病程度较轻，可能原因是伤口太大，伤口木栓化不利于发病并且刀切法在试验中不好控制，最后无法判断是否是因为感染病菌而导致的发病；注射法也不好控制，而且由于伤口较小，不利于软腐病菌侵染。关于苗龄对接种的影响，作者认为苗龄太小，不利于发病，而苗龄在5～6片叶和7～8片时接种并没有表现出太大的区别。所以最终确定接种鉴定的苗龄期为5～7片真叶期。本文结果表明，3种不同接种液对软腐病发病的影响差异不显著，但采用液体NA培养基菌悬浮液接种时软腐病发病程度好于其他两种方法，可能是因为是液体NA 培养基有利于病菌黏附在甘蓝离体叶片表面。

3.4 接种浓度对离体鉴定的影响

接种体的菌悬液浓度是影响软腐病发生的重要因素，本研究表明，菌悬液中病菌含量为64×10.8cfu/mL是最佳接种浓度。

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（责任编辑：杨明丽）