运动与DNA甲基化的研究进展

张海滨 田雪文

摘要：DNA甲基化是基因表观遗传的关键修饰，调控基因表达，在肥胖和II型糖尿病发生机制中起关键作用。针对DNA甲基化检测最经济高效的技术是RRBS技术。研究表明急性和慢性运动与DNA甲基化模式和基因表达的变化有关。介绍了DNA甲基化及其RRBS技术，总结目前关于运动与DNA甲基化的相关研究，以期深入了解运动诱导DNA甲基化的分子机制，并为未来研究提供方向。

关键词：运动；DNA甲基化；RRBS技术

中图分类号：G804.7文献标识码：A文章编号：1009-9840（2018）03-0062-04

Research progress on exercise and DNA methylation

ZHANG Hai-bin1，Tian Xue-wen2

（1. Qufu Normal University， Qufu 273100， Shandong， China； 2. Shandong Institute of Sport Science， Jinan 250102， Shandong， China）

Abstract：DNA methylation is a key modification of gene epigenetics and regulates gene expression. It plays a key role in the pathogenesis of obesity and type 2 diabetes. The most cost-effective technique for detecting DNA methylation is RRBS technology. Studies have shown that acute and chronic exercise is associated with changes in DNA methylation patterns and gene expression. This article briefly introduced DNA methylation and its RRBS technology， summed up the current research on exercise and DNA methylation， in order to understand the molecular mechanisms of exercise-induced DNA methylation， and provide direction for future research.

Key words：exercise； DNA methylation； RRBS technology

收稿日期：2018-03-20

基金項目：山东省社会规划办课题 （16CTYJ22）， 山东省重点研发计划 （2017GSF18115）。

作者简介：张海滨（1991-），男，硕士，研究方向运动人体科学。

通讯作者：田雪文（1978-），女，博士，副研究员，研究方向运动人体科学。运动可训练性已被证实具有强大遗传特质[1-2]。运动可训练性不仅取决于遗传基因编码，还取决于表观遗传信号的修饰[3]。DNA甲基化是调节基因表达的关键表观遗传修饰之一[4]。有研究表明，运动训练能够引起肌肉功能关键基因甲基化状态的改变，从而形成良好的表达模式以提高可训练性[3， 5-7]。运动和DNA甲基化的研究正处在迅速发展阶段，本综述总结了目前运动影响DNA甲基化的相关研究，以期深入了解运动诱导DNA甲基化的分子机制，并为未来研究提供方向。

1DNA甲基化

DNA甲基化是调节基因表达的关键表观遗传修饰之一，能够在维持原有基因组序列完整性的前提下改变遗传表观。1925年，在结核杆菌中最先检测到胞嘧啶的甲基化。1948年，Rollin使用纸色谱法分离量化小牛胸腺DNA成分时，不仅鉴定出胸腺嘧啶、腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤四种核酸碱基，还发现了一种迁移率稍高于胞嘧啶名为“epi胞嘧啶”的微量成分[8]。而这种epi胞嘧啶就是胞嘧啶甲基化形式。DNA甲基化是指在胞嘧啶-鸟嘌呤（CpG）相邻的核苷酸序列上[9]，S-腺苷甲硫氨酸的甲基在甲基转移酶（DNMT）催化下，通过共价结合转移到胞嘧啶5'端的过程[10]。在哺乳动物中存在三种具有活性的DNA甲基转移酶（DNMT）：DNMT1主要负责维持DNA复制过程中甲基化状态；DNMT3A和DNMT3B通常对未甲基化DNA或半甲基化DNA进行重新甲基化[11]。哺乳动物基因组中，大约60%～90%的CpG被甲基化[12]。其他未甲基化CpG聚集成CpG岛，其约包含1%的基因组[13]。哺乳动物基因组中CpG岛位于RNA聚合酶II转录基因的启动子、第一外显子或3'UTR区域内，与其在基因表达中的作用一致[9]。而甲基化的CpGs（mCpGs）则抑制染色质环境，使基因表达沉默。这是因为甲基结合蛋白（MBPs）能够结合至少12个对称的mCpGs，而且MBPs含有组蛋白修饰酶，导致异染色质形成和基因沉默[14]。由此，DNA甲基化程度的高低与基因的表达和沉默密切相关。DNA甲基化在印迹基因表达模式、X染色体失活、转位因子抑制、生物发育和许多疾病机制中发挥重要作用。随着研究的深入，我们了解到更多DNA修饰的存在。C5位胞嘧啶的甲基化通常被用来定义“DNA甲基化”，但相同的碱基也可在其他位置甲基化，例如N3-甲基胞嘧啶（3mC）[15]。但是3mC为DNA损伤的产物，而非真正的信息载体[16]。此外，不仅胞嘧啶可以被甲基化靶向，腺嘌呤也能够被甲基化，例如N6-甲基腺嘌呤[17]。最重要的是，DNA甲基化是可逆的DNA修饰。最近发现了C5位上的新DNA修饰，它们是由DNA去甲基化途径产生的，主要包括C5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）、C5-甲酰基胞嘧啶（5fC）和C5-羧基胞嘧啶（5caC）[18]。另外，Tel酶去甲基化的活性也验证了DNA甲基化可逆性[19]。

山东体育科技第40卷总第174期2018年第3期张海滨，等运动与DNA甲基化的研究进展No.3 20182DNA甲基化测序的RRBS技术

鉴于DNA甲基化的生物学功能及其在疾病中的作用，研究人员开发了许多技术来检测和比较DNA甲基化。减容代表亚硫酸氢盐测序（RRBS）技术由于其低成本，操作简化以及对基因组CpG位点高覆盖率而被科研者广泛应用[20]。RRBS技术首先通过一种限制性内切酶（如BglIII）消化基因组DNA并电泳[21]，利用亚硫酸氢盐使DNA发生变性，未甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，并加上相应衔接子。亚硫酸氢盐转化的DNA产生C-poor链不再互补。然后用转化的衔接子序列特定引物来填充第二条链（G-poor），并进行PCR扩增。最后平端PCR产物在质粒载体中被克隆并测序。通过搜索简化的BglIII片段数据库，RRBS文库产生的序列被投影到基因组上。BglIII片段在琼脂糖凝胶中已经按尺寸选择和亚硫酸氢盐转化。Meissner等[21]人通过检测去甲基转移酶前后小鼠胚胎干细胞甲基化谱，证实了RRBS技术的可行性。之后，科研者通过改用MspI 结合Illumina高通量测序技术和双酶切（MspI，ApeKI）等手段优化RRBS技术[22-24]，进一步提高了RRBS文库建成率和检测覆盖率。然而分析RRBS测序数据仍是一项难题，需要专门的比对/绘图程序。尽管已经开发了几种特定的RRBS序列阅读比对程序，如BSMAP/RRBSMAP[25-26]、BSSEEKER [27]、BISMARK[28]，但仍然缺乏为研究人员提供高质量和可分析数据的综合解决方案。为了解决这一难题，Sun等[29]人开发了SAAP-RRBS程序，该应用程序集成了读取质量评估/清理、比对、甲基化数据提取、注释、报告的可视化，并且可适用于不同BAM文件或单独进行注释， 此外还可以轻松扩展到分析全基因组亚硫酸氢盐测序。在梅奥诊所官方网站SAAP-RRBS已向科研工作者免费开放，这也将促使DNA甲基化得到更广泛的研究。最新的报道表明，Wang等[30]人开发的Q-RRBS能够为单细胞或含有超痕量细胞样品的DNA甲基化分析提供最佳策略。

3运动对DNA甲基化的影响

表观遗传机制涉及基因调控和不同疾病的发展。环境因素可能会改变表观基因组，运动作为环境应激因素与DNA甲基化模式和基因表达的变化有关。

3.1急性运动对DNA甲基化的影响

线粒体是骨骼肌的供能细胞器，因此对骨骼肌至关重要。骨骼肌线粒体功能适应急性运动和耐力训练以及线粒体体积的增加[31]。在一项研究中[32]，长期久坐的年轻男女参与者暴露于急性运动中，以确定急性运动是否会改变骨骼肌中线粒体功能和能量消耗相关基因的DNA甲基化模式。进行DNA甲基化检测时，调查的基因是PGC-1α、PDK4、MYOD1、MEF2A和CS。PGC-1α是骨骼肌中线粒体生物合成、脂肪酸氧化和胰岛素抵抗的关键调节因子，并且在运动中被上调。PDK4是骨骼肌中与高血糖代谢相关的关键基因[33]，在短期高强度和長时间低强度运动后增加[34]。尽管肌肉特异性MYOD1对运动没有明显反应， mRNA表达没有显著变化，然而，PGC-1a和PDK4在运动后立即低甲基化，并在3小时后强烈转录[32]。 因此，高强度运动引起的DNA低甲基化和相应基因转录时机似乎存在差异。另外一项研究表明，糖尿病患者骨骼肌休息时PDK4启动子具有较低的甲基化，PDK4 mRNA水平比非糖尿病患者高出70%，这可能是高胰岛素血症和胰岛素抵抗的结果。而且，仅在健康参与者中，PDK4 mRNA表达响应于慢性运动而增加，在糖尿病患者中不表达[35]。还应该注意的是，骨骼肌中DNA以一种剂量反应的方式进行了低甲基化，小鼠肌肉在体外收缩45分钟后也有类似的发现，这两种结果都暗示了急性运动通过DNA甲基化作用在表观遗传修饰中发挥作用[36]。

3.2慢性运动对DNA甲基化的影响

慢性运动训练后全基因组甲基化改变。Ronn等[37]人通过对健康志愿者和II型糖尿病患者运动干预前后脂肪组织DNA甲基化的监测分析，已经证实了慢性运动与DNA甲基化之间的关系。该研究中，两组参与者的脂肪组织DNA甲基化都发生改变，更特别是在7 663个基因中，其中三分之一显示出改变的mRNA表达水平，包括RALBP1、HDAC4和NCOR2。使用萤光素酶测定，显示RALBP1启动子的体外DNA甲基化增加抑制了转录活性。此外，18例肥胖和21例II型糖尿病候选基因的CpG位点在脂肪组织DNA甲基化中存在差异。这些基因中有6个被观察到mRNA表达同时变化。为了了解体内脂肪组织中差异的DNA甲基化和mRNA表达的基因是否影响脂肪细胞代谢，在3T3-L1脂肪细胞中分别沉默Hdac4和Ncor2，导致胰岛素刺激状态下的脂肪生成增加。这表明，运动诱导人类脂肪组织中DNA甲基化的全基因组变化，潜在影响脂肪细胞代谢。慢性运动训练后基因特定性甲基化改变。一项随机对照试验（RCT）和一项临床研究调查了慢性运动训练对候选基因甲基化状态的影响[38-39]。 RCT检查了p15（细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2B，一种肿瘤抑制基因）和ASC（在胞质溶胶型炎性信号通路中含有介质的PYD和CARD结构域）的甲基化状态，慢性中等强度运动可以增加ASC甲基化，从而抑制过量的促炎细胞因子表达。运动诱导的DNA甲基化改变可能高度依赖于个体的基因型[40]。Alibegovic等[38]通过直接测序测量了20名年轻健康男性的干预后PGC-1a中骨骼肌甲基化的变化。连续9天的卧床休息使PGC-1a启动子中一个CpG位点的甲基化水平增加了39%，这与PGC-1a mRNA水平的降低相关。然后，在卧床休息期后进行为期4周的再训练干预，有改变甲基化可逆性的趋势，但并不显著。此外，PGC-1α的甲基化水平不再与其mRNA表达显著相关。

4總结

DNA甲基化是调节基因表达的关键表观遗传修饰之一，在印迹基因表达模式、X染色体失活、转位因子抑制、生物发育和许多疾病机制中发挥重要作用。针对DNA甲基化检测的RRBS技术也得到广泛应用。已经证实，急性或慢性运动对不同组织中DNA甲基化有显著影响。在运动后发生甲基化水平显著改变的基因，包括与能量代谢、肌肉再生和促炎症相关的基因。深入研究运动训练与DNA甲基化的关系，将为运动治疗II型糖尿病及肥胖提供更加系统的理论支持。然而，运动导致这些DNA甲基化改变的分子途径仍然未知，探讨其分子途径也将是今后关注的重点。

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