香蕉枯萎病菌致病力分化与ISSR遗传多样性分析

黄穗萍 郭堂勋 李其利

摘要 香蕉枯萎病是一種破坏香蕉维管束的全株性土传病害。本研究旨在探讨香蕉枯萎病菌致病力分化和遗传多样性。以30株采自我国广西的香蕉枯萎病菌，16株分别来自澳大利亚和我国广东、海南、福建、云南等地的香蕉枯萎病菌为对象，采用伤根灌淋法测定香蕉枯萎病菌的致病力，然后用筛选到的ISSR引物对46个香蕉枯萎病菌菌株和4个对照菌株（3个非致病性尖孢镰刀菌和1个茄腐镰刀菌）进行ISSR遗传多样性分析。结果显示，分离到广西香蕉枯萎病菌1号生理小种（FOC1）8株，致病力强、中、弱类型比例分别为62.5%、12.5%和25%；广西香蕉枯萎病菌4号生理小种（FOC4）22株，致病力强、中、弱类型比例分别为18.18%、63.64%和18.18%。14条ISSR引物扩增出237个条带，多态性条带161个，多态性比例为67.93%，遗传相似系数0.76～0.96。聚类分析显示，以遗传距离0.80为阈值时菌株被分为8个类群，所占比例分别为4%、10%、60%、16%、4%、2%、2%、2%。第三类群全部为香蕉枯萎病菌4号生理小种。第一、二、四和五类群总量的70.59%为香蕉枯萎病菌1号生理小种。第八类群为香蕉枯萎病菌3号生理小种。结果表明，在香蕉枯萎病菌与寄主协同进化中，广西的FOC1和FOC4出现明显致病力分化。1号生理小种的遗传多样性比4号生理小种丰富。广西香蕉枯萎病菌4号生理小种与海南、广东的FOC4遗传相似性较高。香蕉枯萎病菌生理小种类型与遗传多样性相关。致病力变异与遗传多样性无相关性。研究结果对香蕉枯萎病菌种群扩张机制探讨、遗传动态分析以及有效防控措施的制定具有一定的指导意义。

关键词 香蕉枯萎病； 致病力； 遗传多样性

中图分类号： S 436.681

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2018007

Abstract Banana wilt is a whole-plant soil-borne disease that destroys banana vascular bundles. This study aimed to evaluate the pathogenicity differentiation and genetic diversity ofFusarium oxysporum f.sp.cubense （FOC）. Thirty FOC strains were collected from Guangxi and 16 FOC strains from Australia and Guangdong， Hainan， Fujian， Yunnan of China， and their pathogenicity was tested by root damage irrigation pipe method. The genetic similarity between the 46 FOC strains and four reference strains （three non-pathogenicF. oxysporum and oneF. solani） was studied by ISSR genetic diversity analysis using most suitable primers and annealing temperature. The results showed that eightF. oxysporum f.sp.cubense race 1 （FOC1） strains and 22F. oxysporumf.sp.cubenserace 4 （FOC4） strains were obtained from Guangxi. The proportions of strong， medium and weak pathogenic types of FOC1 were 62.5%， 12.5% and 25%， respectively， while the proportions of strong， medium， and weak pathogenic types of FOC4 were 18.18%， 63.64% and 18.18%， respectively. Fourteen ISSR primers produced totally 237 bands and 161 polymorphic bands， with a polymorphic proportion of 67.93%. The genetic similarity coefficient ranged from 0.76 to 0.96. Cluster analysis showed that， when the genetic distance was 0.80， the strains could be divided into eight groups， with a proportion of 4%， 10%， 60%， 10%， 4%， 2%， 2% and 2%， respectively. Among them， all strains of the third group were FOC4， while 70.59% of strains in the total of 1st， 2nd， 4th and 5th groups were FOC1. The 8th group belonged to FOC3. The results indicated that FOC1 and FOC4 of Guangxi had apparent pathogenicity differentiation with coevolution with the host. At the same time， the genetic diversity of FOC1 was richer than that of FOC4. Higher genetic similarities existed between FOC4 of Guangxi and FOC4 of Hainan， Guangdong. It suggested that the types of FOC species were associated with the genetic diversity， but there was no correlation between pathogenicity variation and genetic diversity. These results may help us understand the population expansion mechanism， analyze genetic dynamics and formulate effective management measures againstF. oxysporum f.sp.cubense.

Key words Fusarium oxysporum f.sp.cubense； pathogenicity； genetic diversity

香蕉枯萎病是由尖孢鐮刀菌古巴专化型Fusarium oxysporum f.sp. cubense侵染引起的破坏香蕉维管束的全株性土传病害，其病原菌适生性强、分布广、危害重、传播途径复杂、防治难度大，是香蕉生产的主要障碍。

根据对寄主的致病性差异，香蕉枯萎病菌分成4个生理小种，即香蕉枯萎病菌1号（FOC1）、2号（FOC2）、3号（FOC3）和4号小种（FOC4），香蕉枯萎病菌4号生理小种又分为热带4号生理小种（TR4）和亚热带4号生理小种（STR4）。中国的香蕉枯萎病菌属于1号和热带4号小种。目前中国的FOC1和FOC TR 4已出现明显致病力分化[1-4]，而且小种内遗传变异非常丰富。

目前研究香蕉枯萎病菌的遗传多样性方法主要有RAPD[3，5-6]、AFLP[7-8]、ISSR等。ISSR （inter simple sequence repeat）是1994年由Zietkiewicz等[9]提出的一种建立在PCR反应基础上的DNA分子标记技术，与其他分子标记相比，该标记具有重复性好、多态性水平高、成本低廉等优点。Thangavelu等[10]应用ISSR标记技术研究了印度98株香蕉枯萎病菌1号和2号生理小种的遗传多样性，发现印度香蕉枯萎病菌遗传多样性非常丰富，且FOC具有多源进化特性；ISSR技术能很好地区分FOC的生理小种类型。张贺等[11]应用ISSR分子标记技术对我国香蕉产区的香蕉枯萎病菌也进行了ISSR分析，认为ISSR聚类组群的划分与病原菌的寄主和小种有很明显的相关性。但是Thangavelu等[10]和张贺等[11]仅是探讨了生理小种类型和寄主与香蕉枯萎病菌遗传多样性的关系，没有研究香蕉枯萎病菌致病力与遗传多样性的关系。

为了探讨香蕉枯萎病菌致病力分化和遗传多样性，本研究于2012-2013年间，从广西香蕉产区采集香蕉枯萎病菌30株，同时收集16株澳大利亚及我国广东、海南、福建和云南等地的香蕉枯萎病菌，测定其致病力，得到具有不同地理来源和致病力的香蕉枯萎病菌株。然后采用ISSR技术研究其遗传多样性，分析致病力、地理来源与遗传多样性的关系，为研究该病害流行和防治技术提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株

供试香蕉枯萎病菌菌株及对照菌株见表1。菌株编号1～31、44、46和47菌株为本实验室分离保存。菌株32、33为中国热带农业科学院环境与植物保护研究所谢艺贤研究员馈赠，菌株34～38、40～43和48为东莞蔬菜香蕉研究所吕顺高级农艺师馈赠，菌株45、49、50为华南农业大学农学院姜子德教授馈赠，菌株39为福建省农业科学院林时迟研究员惠赠。

1.1.2 供试寄主

6～7 叶期粉蕉Musa ABB Group 和巴西蕉Musa AAA Group 组培苗均由广西农业科学院香蕉组培中心提供。

1.2 病原菌致病力测定

香蕉枯萎病菌1号生理小种接种粉蕉Musa ABB group，香蕉枯萎病菌4号生理小种接种巴西蕉Musa AAA group，接种后置于温室大棚培养，40 d后调查香蕉枯萎病的发病情况。计算病情指数和划分菌株的致病力类型。1号生理小种菌株的致病能力以所侵染的粉蕉的病害严重度表示，4号生理小种菌株的致病能力以所侵染的巴西蕉的病害严重度表示。

1.2.1 菌液制备与接种方法

将4℃下保存的各供试菌株置于 PDA 平板培养基上，25℃活化培养5 d。挑取新鲜菌丝接种到PDB液体培养液中，25℃振荡（160 r/min）培养6 d。培养好的菌液用4层纱布过滤菌丝，制成孢子悬浮液。用血球计数板计算孢子悬浮液浓度并用灭菌蒸馏水将孢子悬浮液浓度调整到1×106 cfu/mL，备用。

采用伤根灌淋法测定香蕉枯萎病菌的致病力。将香蕉组培苗自营养杯中拔出后（伤根）重新种到营养杯中。沿着香蕉苗的茎淋50 mL配制好的香蕉枯萎病菌孢子悬浮液。每个处理15株香蕉苗。以清水为对照。

1.2.2 病情调查记载及分级标准

参照Saravanan等[12]的病情调查分级标准，对接种不同菌株的香蕉组培苗的球茎症状进行病级统计，计算病情指数。1级：维管束完全干净，没有变色；2级：维管束出现点状变色，变色面积不足1/3维管束组织；3级：1/3～2/3的维管束组织变色；4级：超过2/3的维管束组织变色，但仍有部分面积没变色；5级：整个维管束组织变色。

病情指数计算公式：

病情指数（DI）=〔（∑各级病株数×相应病级）/（总株数×最高病级）〕×100。

根据病情指数对香蕉枯萎病病原菌进行致病力分级。强致病力（S）：DI≥60.00；中致病力（M）：30≤DI<60.00；弱致病力（W）：30.00≤DI。

1.3 ISSR分析

1.3.1 供试菌株基因组DNA的提取

菌株培养：将供试菌株接种于PDA平板，25℃培养10 d。

DNA提取：用天根DNA提取试剂盒（DP305）提取菌株DNA，具体操作参照天根DNA提取试剂盒说明书。经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测所提取的DNA完整性后，再用超微量紫外可见分光光度计（Thermo Nanodrop ND2000C）检测其纯度与浓度，并将其稀释至10 ng/μL，-20℃贮存备用。

1.3.2 ISSR引物及退火温度筛选

从文献中[10，13-21]选取26对ISSR引物进行初筛选。在供试菌株中选取10个具有代表性的菌株，混合其DNA作为ISSR引物初筛选的模板DNA。每个ISSR引物设置3个退火温度进行PCR扩增。扩增体系为：1× PCR buffer，0.2 mmol/L dNTPs，1.5～2.5 mmol/L MgCl2，0.5 μmol/L引物， 1 Unit ofTaq DNA聚合酶，25 ng基因组DNA。扩增程序为：94℃ 5 min；94℃变性30 s，44～64℃退火45 s，72℃延伸1.5 min，40个循环；72℃延伸7 min，4℃保存。扩增产物在1.5% 琼脂糖凝胶上电泳，70 V，4 h。筛选扩增条带较多、信号强、背景清晰的引物及其合适的退火温度，用于全部 DNA 样品的扩增。

1.3.3 ISSR-PCR扩增及电泳检测

以筛选好的14对引物和退火温度（表3）对全部供试菌株进行PCR扩增，扩增体系和扩增程序按照1.3.2所述。扩增产物在1.5% 琼脂糖凝胶上电泳，70 V，4 h。电泳完毕用凝胶成像系统观察拍照并记录条带。

1.3.4 统计分析

采用 NTSYS-pc 2.0 生物软件，用UPGMAM 法对50个菌株的 ISSR引物扩增条带的统计数据进行聚类分析，建立树状聚类关系图。

2 结果与分析

2.1 广西香蕉枯萎病菌菌株致病力分化与地理来源的关系

由表1所示，供试的广西8株香蕉枯萎病菌1号生理小种（FOC1）侵染香蕉后，香蕉植株的病情指数为5～78.33，平均病指53.96，强、中、弱病株数分别为5、1、2，占FOC1菌株数的62.5%、12.5%和25%。供试的22株香蕉枯萎病菌4号生理小种（FOC4）侵染所致的植株病情指数为11.67～75.00，平均病指42.03，强、中、弱病株数分别为4、14、4，占FOC4菌株数18.18%、63.64%和18.18%。由此可见，广西的FOC1和FOC4均出现明显致病力分化。

从表2可知，FOC1分布于钦州市、玉林市博白县、南宁市、崇左市龙州县；FOC4分布于北海市、钦州市、南宁市及武鸣县、隆安县、百色市平果县。其中钦州市出现了FOC1强、中致病力菌株和FOC4强、中、弱致病力菌株。龙州县出现了FOC1强、弱致病力菌株。武鸣县出现了FOC4强、中、弱致病力菌株。由此可见，菌株致病力强弱与地理来源无显著相关性。

2.2 ISSR引物的扩增

26对ISSR引物中有14对引物的扩增背景清晰，信号强，条带数多，其多态性比例范围为42.86%～100%（表3）。14对引物的序列和合适的退火温度见表3，用于进一步扩增全部菌株的DNA。

14对ISSR引物扩增全部菌株DNA的总条带数为237个，多态性条带数161个，条带大小200～5 000 bp，平均多态性比例为67.93%。其中引物2和引物14的多态性比例为94.12%和100%，分别见图1和图2。由此可见，ISSR指纹具有丰富的多态性，可用于分析FOC的遗传多样性。

2.3 香蕉枯萎病菌ISSR指纹遗传多样性与生理小种的关系

聚类分析显示（图3），在阈值为0.80时菌株被分为8个类群，所占比例分别为4%、10%、60%、16%、4%、2%、2%、2%。FOC4分布于Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅵ类群中，其中第Ⅲ类群全部为香蕉枯萎病菌4号生理小种，占供试FOC4总量的91%。在第Ⅲ类群中，广西FOC4与海南和广东的FOC4遗传距离比云南和福建的短。FOC1分布于Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ类群中，占供试FOC1比例分别为16.7%、25%、41.7%、16.6%。FOC3分布于第Ⅷ类群中。由此可见，香蕉枯萎病菌的遗传多样性丰富，FOC4主要集中在第Ⅲ类群，FOC1分布较为分散，FOC1的遗传变异比FOC4大。广西FOC4与海南、广东的FOC4遗传相似性高。ISSR指纹分析与生理小种类型存在相关性。

2.4 香蕉枯萎病菌ISSR指纹遗传多样性与致病力分化的关系

供试的46个香蕉枯萎病菌中，FOC1有12株，FOC4有33株。FOC1强致病力菌株共7株，分布于Ⅰ类群2株、Ⅱ类群3株、Ⅳ类群2株；中致病力菌株共2株，分布于Ⅳ类群中；弱致病力菌株共3株，分布于Ⅳ类群1株、Ⅴ类群2株。Ⅰ类群和Ⅱ类群的FOC1全部是强致病力菌株；Ⅳ类群中的FOC1有强、中和弱致病力菌株，数量分别是2∶2∶1；Ⅴ类群中的FOC1全部是弱致病力菌株。FOC4强致病力菌株共9株，全部在Ⅲ类群中；中等致病力菌株共16株，分布于Ⅱ类群和Ⅲ类群中，其中Ⅲ类群共15株，占中等致病力菌株总数的93.75%；弱致病力菌株共8株，分布于Ⅲ类群、Ⅳ类群和Ⅵ中，比例分别是75%、12.5%、12.5%（表4）。由此可见，香蕉枯萎病菌ISSR指纹遗传多样性与致病力分化无明显相关性。

3 讨论

香蕉枯萎病病原菌的变异是由寄主和环境因子与病原菌之间的协同进化所导致[5]。植物病原菌在不同的环境、营养条件下，寄主植物外界生态因素作用以及病原菌本身的遗传变异使病原菌的致病力不断发生变化。寄主与病原菌在长期演变的过程中，逐步形成了一些较为稳定的类型[1]。香蕉枯萎病病原菌的群体存在着丰富的遗传多样性[22-23]。

本研究结果发现，FOC致病力强弱与地理来源没有相关性。香蕉枯萎病菌的进化具有多源特性，与 Groenewald 等[7]的研究结果一致。遗传多样性分析表明，1号生理小种的遗传变异较4号生理小种丰富。早在1960年，广西就出现了香蕉枯萎病菌1号生理小种。直到2012年，广西才首次报道了香蕉枯萎病菌4号生理小种的危害。可见，FOC1在广西出现的时间较FOC4早。在与寄主的长期协同进化中，广西FOC1整体群体致病力比较强，以强致病力菌株为优势菌株。而广西FOC4以中等致病力菌株为优势菌株。广西FOC1的遗传多样性较广西FOC4丰富。

本研究发现广西FOC4与海南、广东的FOC4遗传相似性高，亲缘关系较近，推测广西的FOC4由海南和广东的FOC4衍生而來。2011-2012年，海南的香蕉枯萎病处于暴发阶段，很多蕉地不能再种植香蕉。那时，广西的香蕉枯萎病还处于零星发生阶段[24]。海南很多蕉农转移到广西种植香蕉。由于交往的频繁，海南病原菌很可能通过组培苗和农具等途径传播到广西。2008年，广西出现了罕见的冻害，香蕉损害严重。补种香蕉需要大量的组培苗，部分蕉农从广东疫区调运了组培苗到广西钦州等地种植。香蕉枯萎病菌也随着带病的组培苗进入了广西。

张贺等[11]只研究了香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种的遗传多样性，而本研究分析了香蕉枯萎病1号、3号和4号生理小种的遗传多样性，结果发现ISSR指纹分析与1号、3号和4号生理小种存在明显相关性。Thangavelu 等[10]的研究也表明ISSR指纹分析能区分1号和2号生理小种。可见，选取具有代表性的标准菌株，将田间采集的香蕉枯萎病菌菌株与之进行ISSR遗传指纹分析，通过构建聚类树，分析采集到的香蕉枯萎病菌的生理小种类型，以监测香蕉枯萎病菌生理小种变异情况，具有可行性。

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（责任编辑：田 喆）