短时高温胁迫对双斑长跗萤叶甲雌虫游离氨基酸、海藻糖和可溶性糖的影响

马晓江 张志虎 王中 张艳香 陈静

摘要 双斑长跗萤叶甲是新疆北疆棉花的主要害虫之一，为探索短时高温对双斑长跗萤叶甲雌虫部分生理指标的影响，在室内研究了不同高温（33、37、41、45℃）不同时间（0.5、1.5、2.5、6、12 h）处理条件下，双斑长跗萤叶甲雌虫体内游离氨基酸、可溶性糖及海藻糖的变化规律。结果表明：在相同温度处理下，随处理时间的延长，双斑长跗萤叶甲雌虫体内的游离氨基酸含量降低，可溶性糖和海藻糖含量增加；在处理时间相同时，随处理温度的升高，双斑长跗萤叶甲雌虫体内游离氨基酸含量降低，可溶性糖含量和海藻糖含量增加。双斑长跗萤叶甲雌虫对45℃高温也有一定的适应性，这预示着在气候变暖趋势下，双斑长跗萤叶甲仍将是新疆棉花上重要的害虫之一。

关键词 双斑长跗萤叶甲； 高温暴露； 游离氨基酸； 可溶性糖； 海藻糖

中图分类号： S 435.622

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017120

Abstract Monolepta hieroglyphica （Motschulsky） is one of the most serious pests in cotton fields in the north of Xinjiang. This study was aimed to explore the potential physiological and biochemical responses of female adult M. hieroglyphica exposed to high temperature.The variation in free amino acids， total sugar and trehalose in female adult bodies were measured under climate chamber conditions under consistent temperature regimes of 33-45℃ at 4℃ intervals for 0.5 h， 1.5 h， 2.5 h， 6 h and 12 h， respectively.Under the same heat treatment， with the extension of treatment time， the concentration of free amino acids was decreased， while the concentrations of total sugar and trehalose were increased in female adult M. hieroglyphica. For the same treatment time， with rising temperature， the concentration of free amino acids was reduced， but the concentrations of total sugar and trehalose were increased in female adult M. hieroglyphica. M. hieroglyphica even had a certain adaptability to 45℃， and thus is a serious pest to the cotton in Xinjiang under global climate warming.

Key words Monolepta hieroglyphica； high temperature exposure； free amino acid； total sugar； trehalose

雙斑长跗萤叶甲Monolepta hieroglyphica （Motschulsky）属鞘翅目Coleoptera，叶甲科Chrysomelidae，长跗萤叶甲属Monolepta Chevrolat，又称双斑萤叶甲。该虫在国内主要分布于甘肃、宁夏、黑龙江、吉林、辽宁、内蒙古、河北、山西和陕西等21个省/自治区[14]。近些年，新疆棉区棉花耕作方式的改变，棉花种植的集中化及品种的单一化为双斑长跗萤叶甲提供了良好的生存环境，使该叶甲种群迅速扩散蔓延，成为北疆棉区主要害虫之一[5]。双斑长跗萤叶甲以成虫取食棉花叶片，造成棉花叶片表面形成缺刻，甚至坏死斑，使棉花的光合作用受到严重影响，从而给棉花的生产带来巨大损失[67]。目前，有关双斑长跗萤叶甲的研究主要集中于其发生规律、寄主范围、防治方法等[3， 78]。

昆虫属变温动物，环境温度是影响其生长、发育、存活及生殖等生命活动的重要因素。当环境温度超过其适宜温区，就会造成热胁迫。有关环境温度对双斑长跗萤叶甲的影响，仅有对其成虫寿命、繁殖和种群动态的研究[2，9]，而由于气候变暖带来的高温频率增加和日高温升高对双斑长跗萤叶甲的影响尚未见报道。

本研究在实验室条件下采用不同高温与不同时间处理，研究短时高温暴露条件下双斑长跗萤叶甲雌虫体内可溶性糖、游离氨基酸和海藻糖的变化，以期考查双斑长跗萤叶甲对高温胁迫的适应能力，同时对解析该虫的耐热性及夏季田间种群数量动态，制定适宜的防治策略具有重要意义，也为进一步研究高温对双斑长跗萤叶甲影响的生理机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试昆虫

双斑长跗萤叶甲成虫采自新疆石河子大学试验站（43°20′N， 84°45′E）棉田，在自制的养虫盒（10 cm×6 cm×6 cm）内用棉花叶片饲养，饲养条件：PXZ型智能人工气候箱，温度26℃ ± 1℃，光周期L∥D=16 h∥8 h，相对湿度（RH）为 （80% ± 5%）。

1.2 试验材料及仪器

游离氨基酸测定试剂盒和蛋白质测定试剂盒，南京建成生物工程研究所生产；可溶性糖测定试剂盒，上海岚派生物科技有限公司生产；海藻糖测定试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；TGL-16gR型离心机，UV1800型分光光度仪，Varioskan flash 3001型酶标仪。

1.3 试验方法

1.3.1 高温处理方法

试验设33、37、41、45℃ 4个温度处理，温度误差 ± 1℃。每个温度分别设0.5、1.5、2.5、6、12 h 5个处理时间（处理于每日10：00开始）。分别测定不同温度处理不同时间后双斑长跗萤叶甲雌虫游离氨基酸、可溶性糖和海藻糖浓度的变化。每个处理重复3次，每次30头成虫。

1.3.2 游离氨基酸的测定方法

用10 mL離心管称取6～8头经短时高温处理的双斑长跗萤叶甲雌虫活体按质量体积比加入9倍生理盐水，冰水浴条件机械匀浆制成10%匀浆，3 500 r/min离心10 min，取上清液测定蛋白质及游离氨基酸含量。

蛋白质含量测定：取10%匀浆加入9倍生理盐水稀释成1%组织匀浆，然后分别取0.05 mL匀浆液、0.05 mL双蒸水（空白管）、0.05 mL 0.563 g/L蛋白质标准品（标准管）于试管中，依次加入3 mL考马斯亮蓝显色液，混匀，静置10 min，在波长595 nm，光径1 cm，双蒸水调零后测定各管吸光度值，并计算蛋白质含量。

游离氨基酸含量测定：按照游离氨基酸测定试剂盒说明书对样品组织10%匀浆进行处理。波长650 nm，光径1 cm，双蒸水调零，测定各管吸光度值。

蛋白浓度（g/L）=（OD样品-OD空白）×0.563/（OD标准-OD空白），式中0.563为标准品蛋白浓度，单位g/L。

游离氨基酸含量（μmol/mg）=（OD样品-OD空白）/（OD标准-OD空白）×50/该样品的匀浆蛋白浓度（g/L），式中50为游离氨基酸标准品浓度，单位μmol/mL。

1.3.3 海藻糖的测定

采用蒽酮比色法。称取约0.1 g双斑长跗萤叶甲活雌虫，常温研碎，加入1 mL提取液，室温静置45 min，振荡 3～5次，冷却后，1 000 r/min常温离心10 min，取上清液按照可溶性糖测定试剂盒说明书的步骤进行处理。测定波长620 nm，光径1 cm，双蒸水调零，测定各管吸光度值。

海藻糖含量（mg/g鲜重）=[V1×（OD样品-0.072 9）/8.897 6]/（W×V1/V2）=0.112×（OD样品-0.072 9）/W，式中，V1为反应体系中样品体积0.06 mL，V2为提取液总体积1 mL，W为样品质量。

1.3.4 可溶性糖的测定

用1.5 mL离心管称取6～8头经短时高温处理的双斑长跗萤叶甲活雌虫按重量体积比加入4倍生理盐水，制成20%匀浆，3 500 r/min离心10 min，取上清液待测。将可溶性糖标准品用标准品稀释液稀释成240、120、60、30、15 ng/L浓度的标准液各50 μL。将样品上清液及标准品稀释液按照可溶性糖测定试剂盒说明书的步骤依次加入酶标板中，以空白孔调零，用酶标仪在450 nm波长下测定各孔吸光度，通过标准曲线计算样品中昆虫可溶性糖含量。

1.4 数据处理

采用 SPSS 20.0统计软件对所有试验数据进行分析。不同温度和处理时间对双斑长跗萤叶甲雌虫游离氨基酸、可溶性糖和海藻糖的影响采用Duncan氏新复极差法进行差异显著性检验（α=0.05）。采用Excel软件绘图。

2 结果与分析

2.1 高温胁迫下双斑长跗萤叶甲雌虫游离氨基酸含量的变化

经短时高温处理后，与对照（26℃）相比，33、41、45℃下处理不同时间双斑长跗萤叶甲雌虫体内游离氨基酸含量随处理时间的延长而减少，除33℃处理0.5 h外其他处理均显著低于26℃对照，且呈现出处理时间越长，游离氨基酸含量下降幅度越大的趋势。37℃处理除了1.5 h游离氨基酸含量与对照26℃无显著差异外，其他处理时间均显著低于对照（图1）。45℃处理2 h后双斑长跗萤叶甲雌虫全部死亡。

处理时间为0.5 h和2.5 h时，双斑长跗萤叶甲成虫体内的游离氨基酸含量表现为随处理温度的升高而降低。处理1.5 h时游离氨基酸含量以37℃处理的最高，显著高于其他温度处理，33、41、45℃处理差异不显著。处理6 h时，33、37和41℃处理下的成虫体内游离氨基酸含量无显著差异。处理12 h时，41℃处理的游离氨基酸含量显著高于37℃处理，与33℃处理无显著差异（图1）。

2.2 高温胁迫下双斑长跗萤叶甲雌虫海藻糖含量的变化

在同一短时高温（33、37或者45℃）处理下，与对照温度（26℃）相比，双斑长跗萤叶甲雌虫体内的海藻糖含量均随处理时间延长而增加，并且处理时间越长上升幅度越大，而在41℃处理下双斑长跗萤叶甲雌虫体内海藻糖含量先升高后降低再升高（图2）。试验中，双斑长跗萤叶甲雌虫在45℃处理2 h后全部死亡。

在处理时间为0.5、1.5、6或者12 h时，双斑长跗萤叶甲雌虫体内的海藻糖含量均随处理温度的升高而增加，并且处理温度越高上升幅度越大，在处理时间为2.5 h时，双斑长跗萤叶甲雌虫体内的海藻糖含量随温度增加先升高后降低，但仍高于对照（图2）。

2.3 高温胁迫下双斑长跗萤叶甲雌虫可溶性糖含量的变化

在同一短时高温（33、37或者45℃）处理下，与对照温度（26℃）相比，双斑长跗萤叶甲雌虫体内的可溶性糖含量呈现随处理时间的延长而增加的趋势，而在41℃处理下双斑长跗萤叶甲雌虫体内可溶性糖含量先升高后降低再升高（图3）。试验中，双斑长跗萤叶甲雌虫在45℃处理2 h后全部死亡。

处理时间为0.5 h和1.5 h时，双斑长跗萤叶甲雌虫体内的可溶性糖含量均随处理温度的升高而增加，并且处理温度越高上升幅度越大；处理2.5 h时，双斑长跗萤叶甲雌虫体内的可溶性糖含量随处理温度的升高先升高后降低，但仍高于对照；处理6 h时，33、37、41℃下双斑长跗萤叶甲雌虫体内的可溶性糖含量之间无显著差异（图3）。

3 讨论

在全球气候变暖的大环境下，多种昆虫耐热性的增强以及耐受温度范围的拓宽都表现出了昆虫对温度的适应性。双斑长跗萤叶甲在33、37、41、45℃高温短时处理条件下，只有在45℃ 2 h以上处理时全部死亡，其余高温处理下均能正常生长，说明双斑长跗萤叶甲在极端高溫条件下，能迅速提高自身的耐热能力，以适应高温环境。

昆虫为维持其正常的生命活动，其血淋巴中的蛋白质、游离氨基酸等重要代谢物必须维持在一个较为恒定的水平。外界胁迫，如高温、低温、真菌侵入[10]等都会导致免疫蛋白和防御酶类的合成，大量消耗了昆虫体内的游离氨基酸。由此推断，在高温条件下，双斑长跗萤叶甲雌虫体内可能合成大量免疫蛋白和防御酶类，导致游离氨基酸含量大幅度下降。

糖类是昆虫血淋巴的重要组分，是血淋巴贮存和运输能源物质的重要形式。昆虫血淋巴中最主要的糖类为海藻糖，占整个血淋巴中糖类含量的80%～90%[11]。海藻糖还能作为蛋白质稳定剂，以保护昆虫躲避热压力等恶劣环境[12]，能够在高温、高寒、干燥失水等恶劣的条件下在细胞表面形成特殊的保护膜，有效地保护生物分子结构不被破坏[11]。随着温度的升高（33～35℃），双斑长跗萤叶甲成虫体内可溶性糖含量和海藻糖含量也随之上升，这与西伯利亚蝗的研究结果类似[13]，进一步说明双斑长跗萤叶甲成虫对短时高温具有很强的适应性。

新疆属高温干旱地区，双斑长跗萤叶甲成虫发生期正处于新疆高温时期，开展双斑长跗萤叶甲雌虫与短时高温之间关系的研究具有现实和生态意义。根据不同温度处理后双斑长跗萤叶甲的可溶性糖、游离氨基酸和海藻糖的变化趋势，综合分析得出，双斑长跗萤叶甲在33～41℃下，均能正常生长，而且体内可溶性糖和海藻糖一直处于上升阶段，而对45℃的高温也有一定的适应性。表明双斑长跗萤叶甲在高温胁迫下，通过不断积累体内抗逆物质提高自身的耐热能力。这也预示着在新疆气候变暖趋势下，双斑长跗萤叶甲的发生仍会比较严重。本研究结果，为进一步研究高温对双斑长跗萤叶甲影响的生理机制奠定基础。

参考文献

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（责任编辑：田 喆）