离子色谱法测定盐酸头孢噻呋中的氯离子

戴 青，韩宁宁，于丽娜，张 璐，徐 嫄，赵 晖

(中国兽医药品监察所，北京 100081)

头孢噻呋是美国法玛西亚普强公司研制的动物专用第3代头孢类抗生素，主要用于猪细菌性呼吸道感染和鸡的大肠埃希菌、沙门氏菌感染，其抗菌活性强，毒副作用小，残留低，近年来在世界各地应用非常广泛[1-2]。目前，国内已上市的头孢噻呋制剂有头孢噻呋钠粉针剂和盐酸头孢噻呋注射液等[3]。鉴于抗生素品种含量通常以活性成分计，其含量限度的确定，应考虑分子中含酸根离子或盐的量等因素。由于盐酸头孢噻呋比头孢噻呋钠更稳定，在进行头孢噻呋国家对照品的研制时，通常采用盐酸头孢噻呋作为对照品原料，准确测定盐酸头孢噻呋中氯离子的含量，确定成盐比例，可佐证针对药物部分的含量测定结果，从而确保对照品赋值准确。

离子色谱法具有灵敏度高、选择性好、前处理简单、试样用量少等优点，目前已成为分析化学领域中发展最快的分析方法之一，已被广泛地用于无机阴、阳离子和有机离子的测定[4-5]。研究首次建立了盐酸头孢噻呋中氯离子的抑制电导离子色谱检测方法，进而确定其成盐比例，对于头孢噻呋对照品的标定赋值以及进一步完善盐酸头孢噻呋质量标准、提高药品质量稳定性具有重要意义。

1 仪器与试药

Dionex Aquion离子色谱仪和Chromeleon 7软件(美国Thermo公司)；Dionex AERS-4mm抑制器(美国Thermo公司)；Milli-Q超纯水系统(美国Millipore公司)；Mettler Toledo XS 205型电子分析天平(瑞士Mettler公司)。

盐酸头孢噻呋(齐鲁晟华制药有限公司，批号：704067203111)；Cl-标准溶液(中国计量科学研究院，1000 μg/mL，批号：17032)；氢氧化钾淋洗液(Dionex EGC Ⅲ KOH，序列号：161240299015)；亚硝酸钠、氟化钠、硝酸钾、硫酸钾、磷酸氢二钠、溴化钾、溴酸钾(国药集团化学试剂有限公司，均为分析纯)；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Dionex IonPac AS19(250 mm×4 mm，5 μm)，预柱：Dionex IonPac AG19(50 mm×4 mm，5 μm)，流速：1.0 mL/min，柱温：30 ℃，检测池温度：35 ℃，进样量：25 μL，检测器：电导检测器，抑制电流：112 mA，以氢氧化钾溶液为淋洗液按表1梯度洗脱。

表1 梯度淋洗条件Tab 1 Gradient elution conditions

2.2 溶液的制备

2.2.1 标准溶液 精密量取氯离子标准溶液(1000 μg/mL)10 mL，置100 mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为标准储备液。分别精密量取标准储备液适量，加水稀释制成含氯离子分别为0.5、1、2、5、10、20 μg/mL的溶液，作为氯离子标准工作液。

2.2.2 供试品溶液 取盐酸头孢噻呋样品约25 mg，精密称定，置50 mL量瓶中，加4 mmol/L氢氧化钠溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5 mL，置50 mL量瓶中，用4 mmol/L氢氧化钠溶液稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

2.3 专属性试验 分别取亚硝酸钠、氟化钠、硝酸钾、硫酸钾、磷酸氢二钠、溴化钾、溴酸钾适量，精密称定，加水溶解并稀释制成浓度各约100 μg/mL的混合离子溶液，精密量取1 mL，置10 mL量瓶中，加“2.2.1”项下标准储备液1 mL，用水稀释至刻度，作为专属性溶液，按“2.1”项下色谱条件测定。在该色谱条件下，其他离子能与氯离子较好分离，该方法专属性良好，见图1。

2.4 线性关系考察 取氯离子标准工作液，按“2.1”项下色谱条件测定。结果表明：在0.5～20 μg/mL浓度范围内，氯离子溶液的峰面积与其浓度呈良好的线性关系，线性方程为y=0.2917x-0.0177，r2=0.9999。

按F-、BrO3-、Cl-、NO2-、SO42-、Br-、NO3-和PO43-顺序出峰

2.5 检出限与定量限 取氯离子标准工作液适量，用水逐步稀释至一定浓度后测定，氯离子定量限为0.8 μg/mL(S/N>10)，检出限为0.2 μg/mL(S/N>3)。

2.6 精密度试验 取浓度为10 μg/mL的氯离子标准工作液，按“2.1”项下色谱条件连续重复进样6次，计算氯离子峰面积的RSD为1.0%。

2.7 重复性试验 取盐酸头孢噻呋供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，计算氯离子的含量，平均含量为5.92%，RSD为0.5%。氯离子标准工作液及盐酸头孢噻呋供试品溶液色谱图见图2～图3。

图2 氯离子标准工作液色谱图(5 μg/mL)Fig 2 Chromatogram of standard working solution of chloride ion(5 μg/mL)

图3 盐酸头孢噻呋供试品溶液色谱图Fig 3 Chromatogram of ceftiofur hydrochloride test solution

2.8 回收率试验 采用加样回收率试验测定准确度。取已知氯离子含量为5.92%的盐酸头孢噻呋约25 mg，精密称定，置50 mL量瓶中，加4 mmol/L氢氧化钠溶液溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取5 mL，置50 mL量瓶中，分别精密加入氯离子标准储备液(100 μg/mL)1、1.5和3 mL，用4 mmol/L氢氧化钠溶液稀释至刻度，摇匀，制成低、中、高三个浓度的回收率试验溶液。每个浓度平行操作3次，按“2.1”项下色谱条件测定，采用标准曲线法，计算回收率，结果见表2。

表2 氯离子回收率Tab 2 Recovery rate of chloride ion

2.9 稳定性试验 取盐酸头孢噻呋样品约25 mg，精密称定，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，室温静置，分别于0、1、2、4、8、16和24 h按“2.1”项下色谱条件进行测定，计算氯离子峰面积的RSD为0.8%(n=7)。

2.10 样品测定 取供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，采用标准曲线法，计算氯离子含量，再折算成盐酸的含量(盐酸含量=氯离子含量×36.5/35.5)，得到氯离子含量为5.92%，盐酸含量为6.09%。

3 讨论与小结

有些成盐药物分子中成盐位点不唯一，可能以多种比例成盐，对于这类成盐药物的对照品标化，确定成盐比对于对照品赋值十分重要，尤其是当多种定值方式给出的含量差异较大时，更需要去验证成盐比例[6-7]。根据研究结果，若盐酸头孢噻呋的成盐比例为1∶1，则盐酸的理论含量为6.51%，若其成盐比例为1∶2，则盐酸的理论含量为12.23%，若其成盐比例为1∶3，则盐酸的理论含量为17.28%，而样品实测值为6.09%，由此可知，其成盐比例应该为1∶1，以活性成分头孢噻呋计，其理论含量为93.49%。若将盐酸头孢噻呋的成盐率控制在理论值的90.0%～110.0%，则盐酸的含量限度应为5.86%～7.16%。

离子色谱法对于固体样品的前处理比较简单，最常用的方法是用去离子水或氢氧化钠溶液直接溶解配制样品溶液[8]。试验过程中发现样品在超纯水中几乎不溶，因此试验采用浓度较低的氢氧化钠溶液作为溶剂，溶解样品时宜边超声边振摇，使其溶解完全。考虑到样品中可能有保留强度不同的多种离子存在，等度淋洗会出现多种组分共淋洗或强保留组分无法洗脱等现象[9]，因此试验采用梯度洗脱，待氯离子出峰后使用高浓度的KOH淋洗液冲洗色谱柱，将吸附在色谱柱上的强保留性物质洗脱下来，从而得到更好的效果。

离子色谱中无机阴离子的保留行为受到离子价态、离子半径及离子的极化程度等多种因素的影响[10]。研究开发的方法准确、灵敏、专属性好，在本文所述的试验条件下，可实现Cl-与F-、BrO3-、NO2-、SO42-、Br-、NO3-、PO43-等常见阴离子的有效分离，该色谱条件可以适用于盐酸头孢噻呋中Cl-的测定，以控制成盐比例，为头孢噻呋对照品的标定赋值提供了技术参考，为盐酸头孢噻呋质量标准的完善提供了研究基础。

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