半夏两种愈伤组织结构及细胞壁成分比较

胡珊珊， 张明生，吕 享，李小兰，李 欢

(贵州大学 生命科学学院/国家喀斯特石漠化防治工程技术研究中心， 山地植物资源保护与种质创新教育部重点实验室， 贵州 贵阳 550025)

半夏[Pinelliaternata(Thunb.) Breit.].为天南星科多年生草本植物，是我国传统重要中药材之一，具有燥热化痰、降逆止呕、消痞散结等功效[1]。近年来，由于人们对野生半夏的掠夺性采挖，导致其自然资源急剧减少，人工种植是半夏产业可持续发展的必由之路，但长期采用块茎繁殖导致病害严重、种质退化、产量下降[2-6]等一系列问题。半夏人工种子技术已成为近年来的研究热点[7-9]，但半夏人工种子生产中同步化的人工种胚至今仍难获得，其根本原因在于半夏疏松愈伤组织诱导困难，严重限制半夏人工种子的产业化。疏松愈伤组织增殖快，通过悬浮培养，可获得大量均一分散的同步化人工种胚。致密愈伤组织细胞连接紧实而不易分散，不适于作悬浮培养材料。果胶为细胞壁胞间层主要成分，其作用有助于将相邻细胞粘连在一起。纤维素存在于细胞壁的初生壁和次生壁中，可使细胞维持一定形状和延展性。程杰山等[10]研究了不同硬度的辣椒品质在果实发育中果胶、纤维素等的含量变化，发现果胶和纤维素含量变化对不同品系辣椒硬度可能有较大影响。所以，本研究通过对半夏疏松愈伤组织和致密愈伤组织进行石蜡切片显微观察其结构，并分析愈伤组织果胶、纤维素和半纤维素含量，比较研究两种愈伤结构和细胞壁成分差异，以期为进一步研究疏松愈伤组织形成机理奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

半夏[Pinelliaternata(Thunb.) Breit.]由贵州省赫章县半夏药材基地提供。

1.2 方法

愈伤组织的诱导：选择生长15 d的半夏无菌苗，切取叶柄(0.5 cm)作为外植体备用。以MS为基本培养基，加入蔗糖30 g/L，琼脂6.0 g/L，并添加不同质量浓度的2，4-D和6-BA。培养条件：培养基pH 5.8，培养温度(25±1)℃，光照强度2000 lx，光照时间12 h/d。愈伤组织诱导率 = 形成愈伤组织的半夏叶柄数/接入半夏叶柄总数100%。

愈伤组织结构观察及果胶定位：采用常规石蜡切片法[11]，选取诱导出的最疏松和致密的愈伤组织后，用50%福尔马林-乙酸-酒精(FAA)固定液固定，经过酒精梯度脱水、透明、石蜡包埋、番红/钌红-固绿双重染色、中性树胶封片等过程，制成永久切片，显微镜观察并拍照。果胶定位与常规石蜡切片法过程相同，番红染色替换为钌红染色20～30 min即可。

愈伤组织果胶、纤维素和半纤维素的测定：果胶含量采用咔唑-浓硫酸法测定[12]，纤维素含量采用蒽酮比色分光光度法测定[13]，半纤维素含量采用2 mol/L盐酸水解法测定[14]。

1.3 数据分析

试验数据采用Microsoft Excel 2007、SPSS 17.0和GraphPad Prism 7.0软件进行统计学分析。

2 结果与分析

2.1 2，4-D与6-BA组合对半夏愈伤组织诱导的影响

不同浓度2，4-D与6-BA组合对半夏愈伤组织诱导率影响的差异不大，但对其质地有显著影响(表1和图1)。外植体接种10 d后，开始出现灰白色愈伤组织，继续培养，观察到处理4的愈伤组织增殖快，质地较疏松，呈淡黄色(图1 A)。将其培养28～30 d后转到继代培养基上培养，以28～30 d继代一次，继代2～3次可获得颜色淡黄、结构疏松的愈伤组织，该疏松愈伤组织即可通过悬浮培养以获得同步化人工种胚用于半夏人工种子制作。其它处理的愈伤组织的质地均不如处理4的疏松，不适宜用作悬浮培养获得疏松愈伤组织。处理9的愈伤组织增殖慢，质地紧实，继续培养其颜色逐渐变黄加深，并出现分化现象(图1 B)。

表1 2，4-D与6-BA组合对半夏愈伤组织诱导的影响Tab.1 Effects of 2,4-D and 6-BA concentration on callus induction

图1 接种10 d后的半夏愈伤组织Fig.1 Callus of P. ternata 10 days after inoculating

2.2 半夏两种愈伤组织结构及细胞壁成分差异

与致密愈伤组织(图2 A)相比，半夏疏松愈伤组织的结构较松散，细胞及胞间间隙较大，细胞壁较薄(图2 B)。

致密愈伤组织的化学成分定位显示，其细胞壁及细胞间隙中同时存在着色为绿色的纤维素部分及着色为紫色的果胶和纤维素的混合部分(图2 C)，绿色较深，说明其细胞壁纤维素含量较高；而紫色部分较浅，说明其果胶含量较低，即中胶层中细胞粘结物果胶质很少水解成果胶，细胞间连接紧密。疏松愈伤组织的化学成分定位显示出细胞壁及细胞间隙几乎仅存在着色为紫色的果胶与纤维素的混合部分(图2 D)，颜色较深，说明其果胶含量较高，即中胶层中细胞粘结物果胶质大量水解成果胶，细胞间连接被解除，使其愈伤组织细胞松散；而绿色极少，说明其细胞壁纤维素合成较少，含量甚微，使细胞壁刚性减弱，细胞生长加快。

A： 致密愈伤组织番红-固绿染色切片; B： 疏松愈伤组织番红-固绿染色切片; C： 致密愈伤组织钌红-固绿染色果胶定位切片; D： 疏松愈伤组织钌红-固绿染色果胶定位切片

化学成分含量分析结果表明，半夏愈伤组织形成过程中，疏松愈伤组织的果胶含量显著高于致密愈伤组织，是致密愈伤组织的1.2～2.9倍(P0.05)，培养28 d后急剧增加，而致密愈伤组织的果胶含量则一直下降(图3)。致密愈伤组织的纤维素含量显著高于疏松愈伤组织，是疏松愈伤组织的1.9～2.9倍(P0.05)，且一直呈上升趋势，而疏松愈伤组织则有增有减，变幅较小，培养28 d后一直呈下降趋势(图4)。

图3 半夏愈伤组织形成过程中果胶含量变化Fig.3 Veriation of pectin contents during callus formation of P. ternata

图4 半夏愈伤组织形成过程中纤维素含量变化Fig.4 Changes of cellulose contents during callus formation of P. ternata

化学成分含量分析结果与化学成分定位结果有高度的一致性。该研究结果暗示，植物生长调节物质(如2，4-D和6-BA)对半夏愈伤组织形成的类型起着决定性作用，若要获得适于悬浮培养的疏松愈伤组织，则须通过对培养条件的调节(如调节2，4-D与6-BA的配比)以抑制细胞壁纤维素的合成并促进中胶层中果胶质的水解。

3 结论与讨论

植物细胞壁由多糖类、木质素、结构蛋白、无机离子等相互连接而成，而多糖类根据化学提取的难易程度可分为果胶质、纤维素和半纤维素。而植物组织的疏松或致密程度主要与果胶质和纤维素有密切关系。果胶质主要位于细胞间中胶层，是粘结相邻细胞、使组织坚实的重要成分；纤维素是细胞壁的主要成分，是维持植物细胞形态、增强细胞机械强度的物质，因其具有刚性而在一定程度上限制细胞的生长。在植物组织培养进行愈伤组织的诱导和增殖过程中，有时需要获得疏松愈伤组织，尤其是通过细胞悬浮培养同步化诱导产生体细胞胚用于人工种子生产时，疏松愈伤组织更是必不可少。然而，很多植物的组织培养却难以得到疏松愈伤组织，半夏就是其中之一[8-9，15]。众所周知，植物生长调节物质在愈伤组织诱导过程中发挥重要作用，生长素与细胞分裂素的适宜配比可有效地诱导愈伤组织产生[16-17]，常用的生长素有2，4-D和NAA等[18-19]，细胞分裂素有6-BA和KT等[20]。本研究通过2，4-D与6-BA组合试验，筛选出了诱导半夏疏松愈伤组织的最佳激素组合，即在基本培养基中添加1 mg/L 2，4-D和1 mg/L 6-BA。当然，影响植物组织疏松与致密的因素可能还有很多，尚需进一步深入研究。

参考文献：

[1] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典(2010版一部)[M]. 北京： 中国医药科技出版社， 2010.

[2] Hu XF， Fang QL， Li SX，etal. Isolation and characterization of endophytic and rhizosphere bacterial antagonists of soft rot pathogen fromPinelliaternata.[J].FEMSMicrobiologyLetters， 2009， 295(1)： 101-106.

[3] 马小军， 李西文， 杜 鹃， 等. 加权打分法定量评价半夏种质资源的研究[J]. 中国中药杂志， 2006， (12)： 975-977.

[4] 章艳玲， 李关荣， 位运粮. 中药半夏的研究进展[J]. 中国农学通报， 2007， 23(7)： 163-167.

[5] 贾君君， 李 婷， 李 敏， 等. 影响半夏产量因素分析[J]. 世界科学技术(中医药现代化)， 2009， 11(04)： 562-565.

[6] 李 花， 张明生， 彭斯文， 等. 半夏不同种植模式的经济效益分析[J]. 世界科学技术(中医药现代化)， 2009， 11(04)： 566-569.

[7] 薛建平， 张爱民， 盛 玮， 等. 半夏人工种子贮藏技术的研究[J]. 中国中药杂志， 2005， 30(30)： 1820-1823.

[8] 张明生， 李 花. 半夏人工种子制作技术及其萌发研究[J]. 种子， 2009， 28(11)： 4-6， 10.

[9] 申起飞， 张明生， 李立青， 等. 生长调节物质对半夏人工种胚形成的影响[J]. 山地农业生物学报， 2014， 33(03)： 33-36.

[10] 程杰山， 沈火林， 杨学妍， 等. 不同硬度辣椒品系果实组织结构观察与细胞壁物质含量测定[J]. 西北农业学报， 2008， 17(1)： 150-156.

[11] 李正理. 植物制片技术(第二版)[M]. 北京： 科学出版社， 1978.

[12] 赵 伟， 杜映达， 国 微， 等. 北五味子果实中果胶的超声提取工艺研究[J]. 天然产物研究与开发， 2014， 26(08)： 1316-1320.

[13] 李合生. 植物生理生化实验原理和技术[M]. 北京： 高等教育出版社， 2000.

[14] 安玉民， 王菊葵， 黄 烨， 等. 马铃薯秸秆中纤维素与半纤维素含量的测定[J]. 现代农业科技， 2016 (17)： 159-160.

[15] 刘贵贤， 张明生， 李小兰， 等. 适于悬浮培养的半夏疏松愈伤组织诱导及增殖技术[J]. 山地农业生物学报， 2016， 35(01)： 82-85， 94.

[16] 李代丽， 康向阳. 植物愈伤组织培养中内外源激素效应的研究现状与展望[J]. 生物技术通讯， 2007 (03)： 546-548.

[17] 王小菁. 植物生长调节剂在植物组织培养中的应用[M]. 北京： 化学工业出版社， 2010.

[18] 黄衡宇， 王美蓉. 紫背金盘愈伤组织诱导与再生体系的建立[J]. 中草药， 2014， 45(09)： 1313-1318.

[19] 韦 莹， 黄雪彦， 韦坤华， 等. 箭根薯愈伤组织诱导及无性系的建立[J]. 中草药， 2013， 44(17)： 2466-2470.

[20] 李浚明， 朱登云， 植物组织培养教程[M]. 北京： 中国农业大学出版社， 2005.