极干旱区大气PM2.5对质粒DNA的氧化性损伤研究

图尔贡·艾尔肯，迪丽努尔·塔力甫*，邵龙义，买丽克扎提·买合木提，亚力昆江·吐尔逊，阿布力克木·阿布力孜

1. 新疆大学//煤炭清洁转化与化工过程自治区重点实验室，新疆 乌鲁木齐 830046；2. 中国矿业大学资源与地球科学系//煤炭资源与安全开采国家重点实验室，北京 100083

PM2.5为空气动力学当量直径小于2.5 μm的颗粒物质，又称为可吸入肺颗粒物。近几年，随着经济的迅速发展，大气污染严重并且污染范围日益扩大。大气颗粒物会对人体健康（郭新彪等，2013；王文朋等，2015；张小曳等，2013）、能见度（邵龙义等，2000）和气候（殷永文等，2011）产生影响，因而颗粒物污染引发的健康问题受到公众的广泛关注（Costa et al.，1997；白志鹏等，2006；郭辰等，2014；游燕等，2012；周林等，2009）。当PM2.5浓度增高时，心肺疾病的发病率、死亡率也增加，主要出现在患有呼吸、心血管系统疾病的人群及身体状况不佳的老年人中（Costa et al.，1997）。目前为止，人们对 PM2.5的致病机制仍不清楚，颗粒物氧化性损伤假说是目前被广泛接受的观点（Shao et al.，2007；Greenwell et al.，2003），即颗粒物表面的生物可利用的过渡金属离子所产生的自由基（⋅OH）是颗粒物能够产生氧化性损伤的原因（Costa et al.，1997）。胡颖等（2013）使用质粒DNA评价法对北京市大气颗粒物对DNA的损伤的研究表明，北京市大气颗粒物全样的氧化性损伤等于或略大于相应的水溶部分，生物活性随剂量的增加而降低；蓉蓉等（2013）对澳门可吸入颗粒物的氧化性损伤研究表明，澳门中山公园可吸入颗粒物的氧化性损伤能力表现为冬季和夏季基本相同，同一季节不同采样点氧化性损伤能力不同；肖正辉等（2009）对兰州市大气PM10对质粒DNA的损伤研究表明，兰州市大气PM10对质粒DNA的氧化性损伤具有冬、夏季相对较强，春、秋相对较弱的特征；苏都尔·克热木拉等（2014）对乌鲁木齐大气 PM2.5对质粒DNA的损伤研究表明，乌鲁木齐大气PM2.5对质粒DNA的损伤具有全样TD30（大气PM2.5对质粒DNA造成的破坏达到30%时所需要的颗粒物剂量水平）值与平均温度呈显著正相关，水溶部分的TD30值与风速呈显著正相关，与相对湿度呈显著负相关的特征。目前，对全年降水稀少、风沙较多的和田市城区大气PM2.5对质粒DNA氧化性损伤能力、沙尘与非沙尘天气的生物活性的差异、不同风速对生物活性的差异的研究未见报道，故本研究围绕以上内容开展。

和田市南邻昆仑山，西抵喀拉昆仑山和帕米尔高原，东北为浩瀚的塔克拉玛干沙漠，是中国5大沙尘暴多发区之一。年均降水量35 mm，年均蒸发量高达2480 mm，大风天气较多，沙尘暴发生频繁，属干旱荒漠性气候，每年浮尘天气达220 d以上，其中浓浮尘（沙尘暴）天气在60 d左右。因此，利用质粒DNA评价法检测和田城区大气PM2.5对质粒DNA造成的破坏达到 30%时所需要的颗粒物剂量水平（TD30），有利于揭示极干旱区域PM2.5中活性氧对人体健康的影响，同时也可为和田城区大气污染控制工作提供理论依据。

表1 PM2.5样品采集信息Table1 Sample information of airborne PM2.5 collected in Hotan city

1 材料与方法

1.1 材料

高压灭菌的 HPLC级水，TBE缓冲液（sigmaUSA），X174-RF DNA（Promega USA），溴酚蓝染色剂，溴化乙锭（剧毒），琼脂糖（agarose）。采样器为武汉市天虹仪表有限责任公司生产的智能大容量悬浮微粒采样器（TH—1000），采样流量为1.05 m3⋅min-1，采样膜材料为石英微纤维滤膜（英国Whatman公司）。

1.2 样品的采集

采样点设在和田市环境保护局（东经77°30′～84°30′，北纬 34°～38°）4 楼楼顶，距地面 12 m，采样点距和田市主干道500 m，附近没有高层和污染源，能够代表典型城区的空气质量状况。分别于2014年1月、4月、7月和10—11月进行采样，每次采样连续22 h。

用铝箔纸将采集了 PM2.5样品的石英微纤维滤膜包好后置于马弗炉，经450 ℃高温灼烧5 h，恒温、恒湿48 h（温度20±2 ℃，相对湿度45%～55%）后，用AB204-S型分析天平（梅特勒-托利多公司）称量滤膜直至恒重，记录滤膜总质量。所有采集到的样品均置于冷冻柜-18 ℃中保存，以待实验分析。具体采样信息如表1所示。

1.3 质粒DNA损伤评价实验

DNA评价法是一种定量评价PM2.5中活性氧对质粒DNA的氧化性损伤能力的体外方法（胡颖等，2013；苏都尔·克热木拉等，2014；郭茜等，2016），其基本原理是颗粒物表面携带的自由基对超螺旋DNA产生氧化性损伤，最初的损伤表现为超螺旋DNA松弛，进一步损伤表现为DNA线化。这种损伤变化引起DNA在电泳仪中产生电泳淌度的变化，利用这一原理可将不同形态的DNA在琼脂糖凝胶中分离开来，然后使用灵敏的显像测密术测量线状的和松弛状的（被破坏的）DNA在所有DNA中所占的比例，可得出颗粒物对质粒DNA破坏的程度。凝胶制备是将2.5 g琼脂糖和42 mL TBE缓冲液加入到500 mL锥形瓶中，然后加超纯灭菌水至420 mL。将锥形瓶放入微波炉中加热至溶液完全清澈后取出，待溶液冷却至 78 ℃左右时，向锥形瓶中加入10 μL溴化乙锭，然后将锥形瓶中的溶液缓慢倒入放有2个梳子的凝胶浅槽中，直到凝胶完全凝固时轻轻将梳子移开。将凝胶放入电泳槽，向每个梳孔中注入20 μL样品、ϕX174-RF DNA和染色剂三者的混合物，在30 V电压下通电16 h后，使用紫外凝胶成像系统对凝胶进行成像处理。具体实验步骤参见文献（苏都尔·克热木拉等，2014；郭茜等，2016）。

本研究对每个样品进行全样与水溶样品的DNA损伤率比较，并按不同剂量水平进行分析，使用紫外凝胶成像系统对凝胶进行成像，使用Syngene Genetools软件对凝胶中不同形态DNA的光密度进行定量分析和统计，从而得到不同剂量浓度颗粒物对DNA的损伤率。每组剂量水平的样品均设置平行样，以便对照检验实验的准确性；另外，为排除客观因素的影响，每个样品均设置1个不加样品的空白滤膜对照，实验结果取两个平行样品的平均值，再扣除空白对照的影响（Shao et al.，2016）。

图1 和田城区不同风速PM2.5样品的全样和水溶部分的TD30值Fig.1 TD30 of whole sample and corresponding water- soluble fraction of PM2.5 collected from Hotan City in different wind speed

2 结果与讨论

2.1 PM2.5质量浓度分析

风速是反映大气动力稳定性的重要特征量，是与空气污染密切相关的气象参数，它对大气污染物的稀释扩散和三维输送起着重要作用（刘宇等，2002）。从表 1可知，当风速小于或等于 5 km·h-1时，和田市城区PM2.5样品的质量浓度日均值为626 μg·m-3；当风速为 5～10 km·h-1时，其质量浓度日均值为 1180 μg·m-3；当风速大于 10 km·h-1时，PM2.5质量浓度日均值达到 1254.48 μg·m-3。风速越大，PM2.5质量浓度越高，质量浓度与风速大体上呈正相关趋势。杨书申等（2005）在研究风速对颗粒物浓度的影响时发现，风速越大，颗粒物浓度越低，即大气颗粒物的质量浓度与日均风速呈负相关关系，这是因为风速越大，大气污染物越容易稀释扩散。然而，和田城区气候比较干燥，风速越大，越容易导致扬沙和浮尘天气，从而增加大气颗粒物浓度。

2.2 PM2.5对质粒DNA的氧化性损伤

2.2.1 同风速下PM2.5对DNA的氧化性损伤

由图 1可知，同一采样点在不同风速下不仅TD30值差异较大，而且全样和水溶部分对质粒DNA的氧化性损伤也有所差异。不论是全样还是水溶样，其对质粒DNA的氧化性损伤均表现出随风速减小而增大的变化特征。风速小于5 km·h-1时，PM2.5全样和水溶部分 TD30的平均值分别为 4946 μg·mL-1和 6560 μg·mL-1，全样的 TD30值小于水溶部分，可以观测到的最低值分别为 444 μg·mL-1和481 μg·mL-1；当风速在 5～10 km·h-1时，全样和水溶样的 TD30值分别为 7839 μg·mL-1和 7771 μg·mL-1；当风速大于10 km·h-1时，全样和水溶样的TD30平均值分别为 11282 μg·mL-1和 11268 μg·mL-1。且当风速大于5 km·h-1时，全样和水溶样TD30的平均值相差不大。造成这种差异的原因可能是此风速段的样品基本属于冬季和采暖期样品，此时田城区周边的沙尘对 PM2.5的贡献减少，但风速小，污染物长时间扩散不开，再加上燃煤、汽车尾气等排放的大量燃煤飞灰和烟尘集合体长时间漂浮在大气中（李凤菊等，2008），吸附了大量的有毒有害物质，从而导致PM2.5对质粒DNA的氧化性损伤较大。和田城区气候常年干燥，风速较大时扬沙和浮尘天气较多，地壳元素对 PM2.5的贡献较大，使颗粒物的损伤能力降低。肖正辉等（2009）研究表明，2005年12月—2006年10月兰州市区PM10全样和水溶部分的 TD30平均值分别为 26 μg·mL-1和 126.5 μg·mL-1；沈蓉蓉等（2009）研究发现澳门地区冬季PM10的全样和水溶部分的 TD30平均值分别为 11 μg·mL-1和 68 μg·mL-1；2013 年（全年）乌鲁木齐市大气 PM2.5全样和水溶部分 TD30的平均值分别为487.25 μg·mL-1和 615.25 μg·mL-1（苏都尔·克热木拉等，2014）。以上研究结果均小于和田市城区风速小于5 km·h-1时TD30全样和水溶部分的平均值。由此认为，和田市城区 PM2.5的全样和水溶部分的氧化损伤能力均低于以上城市。

2.2.2 沙尘与非沙尘PM2.5对质粒DNA损伤的差异

图2显示了沙尘天气和非沙尘天气PM2.5的全样和水溶部分的TD30值。在沙尘天气，全样和水溶部分的 TD30平均值分别为 9464 μg·mL-1和 8008 μg·mL-1，非沙尘天气分别为 5949 μg·mL-1和 7822 μg·mL-1。表明沙尘天气的全样和水溶部分的 TD30值大于非沙尘天气，即沙尘天气期间 PM2.5对质粒DNA的氧化性损伤相对较小。对北京春季沙尘暴期间采集的 PM10样品进行分析，发现颗粒物的质量浓度高达1200 μg·m-3，仍未对DNA产生损伤（时宗波等，2004），肖正辉等（2009）对兰州春季沙尘天气的研究揭示，沙尘天气 PM10的全样和水溶部分沙尘颗粒物的氧化性损伤能力通常低于非沙尘颗粒。本研究结果与以上结论相一致。Shao et al.（2006）和 Sandström et al.（2005）研究也进一步证实了沙尘颗粒物的氧化性损伤低于非沙尘颗粒。其原因是由于沙尘暴期间 PM2.5中的颗粒物以来自地表的较粗矿物颗粒为主，其表面吸附的水溶性微量元素含量相对较低。

图2 沙尘与非沙尘PM2.5样品的全样和水溶部分的TD30值Fig.2 TD30 of whole sample and corresponding water soluble fraction of PM2.5 at dust and no-dust period in Hotan City

2.2.3 沙尘与非沙尘天气

一般认为，大气颗粒物样品的肺部毒性来自于水溶组分（迪丽努尔·塔力甫等，2011），而Imrich et al.（2000）则指出，浓缩的大气颗粒物中的不可溶部分可引起肺泡巨噬细胞的生物反应。由图2可知，虽然非沙尘天气7月20日、7月23日、4月8日样品全样的TD30值大于水溶部分的TD30值，但其他样品水溶部分的TD30值大于全样。这表明非沙尘天气情况下，和田市城区全样的毒性大于相应的水溶部分，即DNA的氧化性损伤可能主要来源于全样。就沙尘暴天气的样品而言，除4月13日、10月29日采集的样品其全样的TD30值小于水溶样的TD30值外，其余样品的水溶部分的 TD30值均小于全样的TD30值，这表明全样的毒性小于相应的水溶部分，即DNA的氧化性损伤可能主要来源于水溶成分。该结论与郭茜等（2016）、胡颖等（2013）、沈蓉蓉等（2009）、苏都尔·克热木拉等（2014）、肖正辉等（2009）的结论相同。

2.2.4 TD30值与相应PM2.5质量浓度的相关性分析

可吸入肺颗粒物的质量浓度是目前空气质量的主要标准之一。由图3可知，当风速小于或等于5 km·h-1时，和田市城区 PM2.5质量浓度日均值为626 μg·m-3，全样和水溶样 TD30平均值分别为 4946 μg·mL-1和 6560 μg·mL-1；当风速介于 5～10 km·h-1时，和田城区 PM2.5质量浓度日均值为 1180 μg·m-3，全样和水溶样的TD30均值分别为7839 μg·mL-1和7771 μg·mL-1；当风速大于 10 km·h-1时，和田城区PM2.5质量浓度日均值达到 1254.48 μg·m-3，全样和水溶样的 TD30平均值分别为 11282 μg·mL-1和11268 μg·mL-1。在 0.05置信度水平下，全样（r2=0.80）、水溶部分（r2=0.60）TD30的平均值与平均质量浓度之间有着明显的正相关趋势。乌鲁木齐市TD30值与相应的PM2.5质量浓度的相关性分析证明，不论是全样还是水溶部分的TD30，均与相应的质量浓度之间没有相关性（苏都尔·克热木拉等，2014）。而和田城区PM2.5的质量浓度越高，其对质粒DNA的氧化性损伤就越小，这一结论与宋晓焱等（2010）得出的风速大的条件下单位质量浓度毒性较弱的结论相一致。

图3 PM2.5的全样和水溶部分的TD30值与相应质量浓度之间的相关性Fig.3 Correlation between TD30 of whole sample and corresponding water-soluble fraction with corresponding mass concentrations

3 结论

（1）和田市城区不同风速条件下大气 PM2.5的质量浓度有较大的差异，具有风速越大，PM2.5质量浓度越高的变化特征。

（2）不论是全样还是水溶样，其对质粒 DNA的氧化性损伤均表现出随风速减小而增大的变化特征。

（3）沙尘期间PM2.5对DNA的氧化性损伤小于非沙尘天气；沙尘期间PM2.5对DNA的氧化性损伤可能主要来自水溶部分。

（4）和田市城区PM2.5质量浓度与TD30值呈正相关趋势，即 PM2.5质量浓度越高，其氧化性损伤越高。

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