照山白浸膏片TLC鉴别和HPLC特征图谱研究＊

崔小丽，王志轩，邱明山，姚宝林，郭海平

（1.承德市食品药品检验检测中心 承德 067000；2.承德燕峰药业有限责任公司 承德 067000）

照山白浸膏片由7%照山白饮片细粉和93%照山白饮片经水煮的浸膏混合制成的片剂，具有祛风散寒、活血通络、祛痰止咳的功效，用于妇女产后风寒身痛、月经不调、痛经、老年慢性气管炎。标准收载于《卫生部药品标准》中药成方制剂第三册，仅有显微和理化鉴别，质控指标单一，专属性差。有研究表明照山白叶中含皂苷、鞣质、还原性物质、多糖类、挥发油及黄酮类和酚酸类等，其中黄酮类成分有抗炎作用[1-3]。为提高产品质量控制水平，本实验以照山白为对照药材，金丝桃苷、槲皮素、山柰素为对照品，分别建立TLC鉴别方法和HPLC特征图谱。

1 仪器与试药

半自动点样仪：CAMAG LINOMAT5；薄层色谱成像仪:CAMAG TLC VISUALIZER2；高效液相色谱仪：Waters e2695；电子天平：METTLER TOLEDO AG135；甲醇、乙腈（色谱纯，菲舍尔公司）；甲醇、乙醇（分析纯，天津市康科德科技）；娃哈哈纯净水。对照品（中检院）：金丝桃苷（批号111521-201507）、槲皮素（100081-201509）、山柰素（110861-201310）。照山白对照药材：采自承德丰宁，经鉴定为杜鹃花科植物照山白Rhododendron micranthum Turcz.的干燥带叶枝梢。照山白浸膏片为承德燕峰药业有限公司生产，10批次，原料为带叶枝梢。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别方法

2.1.1 供试品溶液的制备

取本品1片，去包衣，研细，置具塞锥形瓶中，加70%乙醇20 ml，超声处理10分钟，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加70%乙醇4 ml使溶解，即得。

表1 梯度洗脱条件

图1 金丝桃苷薄层色谱图(烟台G板，批号2016110)

图2 槲皮素、山柰素薄层色谱图(烟台G板，批号2016110)

2.1.2 对照品溶液的制备

取金丝桃苷、槲皮素、山柰素对照品分别加70%乙醇制成每1 ml各含0.5 mg的溶液，即得。

2.1.3 对照药材溶液的制备

取照山白对照药材粉末0.5 g，置具塞锥形瓶中，加70%乙醇20 ml，超声处理10分钟，放冷，滤过，滤液蒸干，残渣加70%乙醇1 ml使溶解，即得。

2.1.4 薄层色谱条件

照《中国药典》2015年版四部通则0502薄层色谱法进行。

色谱条件1：吸取供试品溶液、对照药材溶液及金丝桃苷对照品溶液各1 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-水(8∶1∶1)为展开剂，展开，展距10 cm，取出，晾干。

色谱条件2：吸取上述供试品溶液、槲皮素和山柰素对照品溶液各1 μl，对照药材溶液2 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环已烷-乙酸乙酯-甲酸（5∶4∶0.5）为展开剂，展开，展距10 cm，取出，晾干。

2.1.5 显色观察与结果

均喷以5%三氯化铝乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰，在紫外光灯(365 nm)下检视。结果：供试品色谱中，在与对照药材及各对照品色谱相应位置上显相同颜色的荧光斑点。见图1、图2。

2.1.6 耐用性试验

分别考察了4个厂家的硅胶G高效薄层板（烟台化工、青岛谱科、青岛海洋、Merck）在不同温湿度条件下的色谱结果，斑点均分离良好。

2.2 高效液相特征图谱测定方法

2.2.1 对照品溶液制备

取金丝桃苷、槲皮素、山柰素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 ml各含100 μg、10 μg、3 μg的混合溶液，即得。

2.2.2 供试品溶液制备

取本品10片，去包衣，研细，取0.3 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇20 ml，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 色谱条件与系统适用性试验

C18柱；乙腈为流动相A，0.1%磷酸为流动相B，按表1梯度洗脱，检测波长366nm；柱温30℃；流速1ml·min-1；进样10 μl。理论板数以金丝桃苷计不低于3 000。

2.3 高效液相特征图谱方法学考察

2.3.1 重复性试验

取同一批样品（S1），按2.2.2项下方法制备供试品溶液6份，按2.2.3色谱条件进行分析，特征图谱以金丝桃苷为参照峰，计算各色谱峰的相对保留时间，结果各色谱峰的相对保留时间的RSD＜0.45%，表明重复性良好。

图3 混合对照品(A)、对照特征图谱（B）和10批次照山白浸膏片（C）HPLC色谱图

2.3.2 精密度试验

取同一批样品（S1），按2.2项下方法制备和测定，连续进样6次，结果各色谱峰的相对保留时间的RSD＜0.20%，表明精密度良好。

2.3.3 稳定性试验

按2.2.2项下方法制备供试品溶液，按2.2.3色谱条件，分别于0、2、6、12、24、48 h进样分析。结果各色谱峰的相对保留时间的RSD＜0.51%，表明供试品溶液在48 h内稳定。

2.4 高效液相特征图谱确立

取10批样品，按2.2项下方法制备和测定，记录色谱图，结果10批样品谱图一致，见图3-C。除特别小的峰外，将其中12个色谱峰做为特征峰，并按出峰时间顺序进行编号。峰5（金丝桃苷）面积最大，做为参照峰；峰11（槲皮素）、峰12（山柰素）明确归属。试验以此结果确定对照特征图谱（见图3-B）：供试品特征图谱中应有12个特征峰，与参照物（金丝桃苷）相对应的为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±5%之内，规定值为0.63（峰1）、0.67（峰2）、0.71（峰3）、0.95（峰4）、1.00（峰S）、1.01（峰 6）、1.03（峰 7）、1.10（峰 8）、1.16（峰 9）、1.17（峰10）、1.65（峰11）、1.77（峰12）。

3 讨论与分析

实验在建立TLC鉴别方法时，未能实现用同一展开系统对3个已知成分的同时分离，故采用了2个展开系统。在建立HPLC方法[4-5]时，对检测波长的确定，流动相、提取溶剂和方法的选择，不同色谱仪（Agilent 1 260，Waters e2695），不同色谱柱（Agilent ZORBAX、Thermo BOS HYPERSIL、SHISEIDO CAPCELL PAK）等进行了系统考察。为分离出更多的成分峰，采用梯度洗脱并优化梯度洗脱时间段及洗脱比例，最终选择了本实验的色谱条件并通过方法学验证（含量测定另文报道），证实所选色谱系统适用性好，结果可靠。本方法简便、准确、重现性好，适用于照山白浸膏片特征图谱检查。稳定性方面，除考察了样品溶液的稳定性外（48小时），还对样品在室温下贮藏1—3年后的特征图谱进行考察，结果样品稳定。本实验所建立的照山白浸膏片TLC鉴别方法及HPLC特征图谱，是以承德地产野生照山白药材为原料。在本研究前期，曾对不同产区（北京、承德与东北）和不同药用部位（叶与带叶枝梢）的照山白药材进行了比较研究，结果其TLC及HPLC特征图谱确因生长地域不同而略存差异，叶与带叶枝梢差异不明显。所以，有针对性地对特定产品制定标准，就能从源头杜绝假冒，有效保护企业自有品种，为打造自有品牌提供技术支撑。照山白含浸木毒素等有毒成分，目前缺少相应对照品，下一步将就安全性指标进行研究。

1 杨秀岭,袁志芳,张兰桐,等.照山白总黄酮的药理作用研究.中草药,2006,37(4):583-584

2 张孟科,照山白、贵州鼠尾草和新疆鼠尾草化学成分及生物活性研究.武汉:华中科技大学博士学位论文,2015:123-124.

3 李福荣,胡月华,张伟,等.泰山照山白提取物对过氧化损伤的PC12细胞的保护作用.泰山医学院学报2013,34(3):170-172

4 国家药典委员会.中国药典2015年版(一部).2015:309

5 王志轩,刘喜刚,崔小丽,等.HPLC法测定照山白中金丝桃苷、槲皮素和山柰素的含量.天津药学,2016(1):102-103.