速效救心丸治疗心肌缺血疾病的网络药理学研究＊

雷 伟，邓艳芳，姜 民，白 刚

（南开大学药学院 天津 300350）

缺血性心脏病是最严重的心血管疾病之一，在全世界都有较高的发病率和死亡率[1]。心肌缺血是指心肌耗氧量和冠状动脉供血、供氧之间不平衡而导致的缺血性心脏病[2]。目前治疗心肌缺血的药物主要包括以下几大类：亚硝酸酯和硝酸酯类、Ca2+拮抗剂类、血管紧张素转换酶（ACE）抑制剂、β-受体阻滞剂和心肌代谢药[3]。由于以上成分单一的化药会出现严重的耐药性，不良反应如头痛、头晕、面红、低血压等和严格的使用禁忌，使得人们将发现抗心肌缺血疾病治疗药物的目光投向了多成分、多靶点和多条生物代谢途径协同发挥作用的中药。

速效救心丸是由川芎、冰片组成的中药复方，临床上它被广泛应用于心脑血管疾病。近30年的临床应用中，速效救心丸被广泛用来治疗冠心病、心绞痛、心肌梗死等疾病，并获得了很好的疗效，且无明显副作用和药物抵抗[4-6]。速效救心丸中研究较为广泛的化学成分有藁本内酯、洋川芎内酯I、川芎嗪、阿魏酸等。藁本内酯是川芎挥发油中的主要成分，也是速效救心丸的主要成分；前人对其研究显示藁本内酯能够抑制由氯化钙和去甲肾上腺素酒石酸导致的离体腹主动脉收缩，暗示藁本内酯的作用类似于钙离子拮抗剂维拉帕米[7]，药代学研究显示藁本内酯在体内主要经历氧化、还原、水解的I相代谢和与氨基酸、葡糖苷酸、谷胱甘肽等结合的Ⅱ相代谢反应[8]。川芎嗪作为重要的生物碱类成分能够激活PI3K/AKT通路[9]，减少缺血导致的心肌细胞电功能紊乱。阿魏酸作为重要的酚酸类成分，能够增强内皮生长因子和血小板源生长因子的表达，上调低氧诱导因子mRNA和蛋白的表达等[10]。现代药理学研究发现速效救心丸能够有效改善心肌缺血，增加冠脉血流，减少心肌梗死面积等。但由于其化学成分复杂、结构多样，以及缺乏合适的分析方法，使得速效救心丸分子网络层面的研究仍未见报道。

网络药理学是从整体层面上来研究药物与机体之间的相互作用关系，通过网络分析方法系统整合并可视化多成分与多靶点之间的相互作用；网络药理学遵循勒夏列特原理，即认为生物体的健康状态是一个平衡体系，疾病会使这个平衡体系发生偏移，而药物能使这个平衡体系的改变减弱(1)任郭珉.基于文本挖掘的药用植物数据库的建立及网络药理学分析D.北京:北京协和医学院硕士学位论文,2014.；这种思想与中医药“整体观”的传统理论相吻合，因此网络药理学在系统生物整体角度阐明中药发挥作用的潜在机制方面得到了广泛的应用，已经初步完成了对茵陈蒿汤、四物汤、清肺消炎丸等的机制预测[11-13]。

本研究通过网络药理学研究技术挖掘速效救心丸主要活性成分的作用靶点，构建成分-靶点网络，并通过蛋白互作分析预测靶点之间的相互作用关系，从分子网络层面系统地阐明速效救心丸对心肌缺血疾病的多成分、多靶点、多生物途径的作用机制。

1 材料与方法

1.1 化合物信息

化合物信息：1.龙脑（C10H8O），2.咖啡酸（C9H8O4），3.藁本内酯（C12H14O2），4.丁基苯酞（C12H14O2），5.川芎嗪（C8H12N2），6.川芎内酯G（C12H16O3），7.川芎内酯F（C12H14O3），8.川芎内酯 D（C12H14O4），9.川芎内酯 C（C12H12O3），10.川芎内酯A（C12H16O2），11.川芎内酯I（C12H16O4），12.川芎内酯E（C12H12O3），13.阿魏酸（C10H10O4），14.4,7-二羟基-4丁基苯酞（C12H14O4），15.3-丁基-4-羟基苯酞（C12H14O3），16.丁烯苯酞（C12H12O2），17.原儿茶酸（C7H6O4），18.香草酸（C8H8O4），19.蛇床内酯（C12H18O2），20.阿魏酰奎宁酸（C17H20O9），21.二聚藁本内酯（C24H28O4），22.二聚藁本内酯（C24H30O4）。以上化合物的化学信息引自美国化学文摘数据库（Chemical Abstract Service，CAS），并将每个化合物的结构使用ChemBioOffice 2010软件转化成PharmMapper可识别的.sdf格式。

1.2 化合物吸收能力预测

对速效救心丸中鉴定的化合物进行吸收性质的计算预测，采用五原则、TPSA和旋转键数的方法进行。

（1）五原则：1997年Lipinski对2287药物分子的结构特征进行了分析，这2287个分子基本上通过了一期临床的实验。分析结构表明，如果一个药物分子具有好的吸收和穿透特性，应符合下面的规则：①氢键给体（连接在N和O上的氢原子数）数目小于5；②氢键受体（N和O的数目）数目小于10；③相对分子质量小于500；④脂水分配系数小于5。

化合物同时不符合四个限制条件的任意两个，其吸收不好预测准确率可达90%以上，若同时不符合三个条件，预测结果就会相当可靠。

药物分子量由ChemBioOffice 2010软件（Cambridge-Soft Corporation）计算，ClogP由CloP 4.0 program软件（BioByte Corporation，Claremont，CA）计算，氢键给体、氢键供体、TPSA和旋转键数由互联网Molinspiration Property Calculation Services计算

1.3 潜在作用靶点反向预测

以药物小分子为探针，搜索活性小分子的潜在蛋白靶点，据此预测药物小分子的活性，此为“反向药效团匹配方法”[14]。将化合物.sdf文件上传至PharmMapper数据库（http://59.78.96.61/pharmmapper/），选择允许化合物存在构象变化，最大构象数设在100，选择靶点集限定于人，产生虚拟筛选结果。在Uniprot数据库中，将PharmMapper得到的蛋白名称使用UniprotKB搜索功能转化为蛋白标准名称。

1.4 代谢通路预测

通常认为，药物靶点富集的通路，即是药物能够干扰和调控的代谢通路，我们使用MAS 3.0（http://bioinfo.capitalbio.com/mas3/）生物分子功能注释平台对靶点蛋白进行GO富集分析和KEGG通路注释分析。对于筛选出的代谢通路，人为选择p值小于0.01，即相关性较大的代谢通路，进行后续分析。

1.5 活性成分-靶点-通路网络构建

采用Cytoscape软件的Merge功能对速效救心丸的活性成分、靶点蛋白、富集通路进行网络模型构建[15]。活性成分、靶点蛋白、代谢通路以不同颜色和形状的节点表示，活性成分与其作用靶点蛋白之间用边连接起来，靶点蛋白与其富集的通路之间也用边连接，当某一活性成分、代谢通路作用于相同的靶点蛋白时，活性成分和代谢通路也可连接起来。

1.6 蛋白互作分析

将速效救心丸中吸收较好的化合物靶点蛋白输入String 9.1（http://String-db.org/）数据库中，进行蛋白相互作用信息的收集。选取蛋白相互作用得分值大于0.7的蛋白互作关系，将获得数据导入Cytoscape软件，进行功能模块分析。

蛋白质通过彼此之间相互作用结合成一个集合体来完成生物学功能，这些紧密联系的结合体即为功能模块[16]。MCODE算法是一种基于图论的聚类算法，它能够在大规模蛋白质网络中检测出稠密连通区域即功能模块，并对模块中蛋白的关联程度进行打分[17]。本实验采用MCODE算法对速效救心丸的蛋白互作网络进行模块识别，将识别模块大小的K-core设为3，即识别出的功能模块至少含有4条边。利用Cytoscape中的BinGO插件对识别出的不同功能模块进行功能注释，其中显著性选择0.05。通过分析蛋白互作关系，有利于从系统层面研究速效救心丸的药效机制。

2 结果

2.1 化合物吸收能力分析

血清药物化学的观点认为，药物中被吸收入血的成分才有可能被血液输送到作用器官或部位来发挥药效，因此化合物能否被人体有效吸收是决定其是否发挥药效的重要标准。速效救心丸中，能够被有效检测到的化合物有22种，将这些化合物通过五原则、TPSA和旋转键数筛选方法进行筛选，共预测到19个吸收较好的化合物，结果如表1。

2.2 速效救心丸成分-靶点-代谢通路网络

将19个吸收较好的化合物结构信息投入到PharmMapper数据库中进行反向靶点预测，将PharmMapper返回的靶点蛋白与Pubmed数据库文献检索的结果进行整合。19个化合物对应的靶点蛋白依据匹配度（fit value）进行筛选，共得到71个相关性较大的靶点蛋白，将对应的靶点蛋白标准名称投入Mas 3.0中，进行代谢通路预测，筛选出与心肌缺血相关的代谢通路53条，建立活性成分-靶点-代谢通路网络如图1、表2。从网络药理学研究结果显示，速效救心丸中19个主要成分涉及的代谢通路有MAPK信号通路、氨基酸代谢、VEGF信号通路、PPAR代谢通路等。

2.3 蛋白互作分析

心肌缺血疾病是复杂疾病，其发生发展必定涉及到许多具有生物功能的蛋白与蛋白之间的相互作用，因此研究速效救心丸的靶点蛋白与蛋白之间互作分析有助于揭示速效救心丸改善心肌缺血疾病的潜在机制。借助String 9.1（http://String-db.org/）数据库，对速效救心丸的靶点蛋白进行互作分析结果如图2。蛋白质通过彼此之间相互作用结合成一个集合体来完成生物学功能，这些紧密联系的结合体即为功能模块。识别功能模块借助的是MCODE算法，它是一种基于图论的聚类算法，它能够在大规模蛋白质网络中检测出稠密连通的功能模块，并对模块中蛋白的关联程度进行打分。借助MCODE算法和BinGo分析对速效救心丸蛋白互作网络中的功能模块进行识别和解读，有利于从系统层面研究速效救心丸的药效机制（图3，表3）。从蛋白互作网络中识别出5个主要的功能模块，分别与脂质和固醇荷尔蒙的相关代谢、谷胱甘肽和氨基酸的相关代谢、炎症反应和免疫功能、心肌功能和能量供应及血压调节等方面相关。蛋白互作分析结果显示速效救心丸中主要化学成分通过调节心脏能量供应、脂质紊乱、免疫反应等发挥了改善心肌缺血疾病的作用。

表1 化合物吸收能力预测

图1 “成分-靶点-通路”药理学网络” 化学成分，靶点蛋白，代谢通路

图2 19个成分对应靶点蛋白的蛋白互作分析网络

表2 网络药理学“成分-靶点-通路”表格

图3 蛋白互作网络中识别的主要功能模块

3 讨论

脂质是人体内大量存在的代谢物，它参与了人体中许多重要的生物学过程：血小板激活、细胞信号传导、细胞骨架形成等[18,19]。伴有冠脉硬化的冠心病中，脂质代谢的紊乱也与炎症、氧化应激、巨噬细胞凋亡密切相关[20]；随年龄增大发生的线粒体功能紊乱和异常的线粒体脂肪酸氧化密不可分，与此同时异常的线粒体脂肪酸氧化也增加了冠心病的发生风险[21]。除了脂质代谢与冠心病相关外，固醇荷尔蒙代谢也与冠心病关系密切。硫酸化的肾上腺激素DHEAS对胰岛素敏感性和脂质代谢发挥了直接作用关系，并且降低的DHEA和DHEAS血清浓度预示了增加的冠心病风险[22]；基于UPLC-QTOF/MS的代谢组学试验中，Cer(t18:0/16:0)、Cer(d18:0/12:0)、Cer(d18:0/14:0)等固醇荷尔蒙可以作为潜在的生物标志物来区分健康者与稳定心绞痛患者、急性冠心病患者[23]。因此，脂质代谢和固醇荷尔蒙相关代谢是冠心病发生、发展过程中的重要代谢通路，积极控制脂质代谢和固醇荷尔蒙代谢的紊乱能够有效改善冠心病。前人研究显示，速效救心丸能够降低ApoE敲除小鼠的血清甘油三酯的水平，并能够稳定动脉粥样硬化的斑块[24]。我们的网络药理学研究显示，MCODE算法识别的功能模块1包括了脂质代谢(GO:0071396、GO:0033993)和固醇荷尔蒙代谢(GO:0043401、GO:0071383、GO:0048545)，因此我们推测速效救心丸可以通过调节脂质代谢和固醇荷尔蒙类代谢发挥其改善冠心病的作用。

表3 代谢通路Go功能富集分析

氨基酸代谢在冠心病发生、发展过程中发挥着重要作用，它的变化与机体的氧化应激、能量供应等密切相关。氨基酸是重要的能量先导体，它能够增加体内ATP的形成并在心肌缺血疾病中，对心肌细胞发挥能量供给作用[25,26]。组氨酸既是自由基清除剂，作为组胺的前体又是机体的能量供应；缬氨酸、色氨酸、异亮氨酸等都可以作为心脏的能量替代供应者[26]。心肌缺血会破坏心肌细胞的结构，增加心肌细胞蛋白水解[27]，因此调节氨基酸相关代谢有助于心肌细胞的结构重建并有助于补充和修复胞内蛋白。在冠心病患者心肌缺血的状态下，药物对氨基酸代谢的改善，能够增加对心肌的能量供应，维持心肌细胞的正常结构和功能。本研究的功能模块2将速效救心丸的功能富集在氨基酸相关代谢通路（GO:0006575、GO:0043603、GO:1901564），功能模块4包括AMP相关代谢（GO:0046033）、糖类代谢（GO:1901136）等都与能量供应相关。这说明速效救心丸可以通过改善冠心病患者的氨基酸和糖代谢等来改善心肌的能量供应，维持心肌细胞的结构和功能。功能模块2还包括谷胱甘肽相关代谢（GO:0006749），谷胱甘肽是体内重要的抗氧化剂[28]，速效救心丸对谷胱甘肽代谢过程的调节能够改善机体的氧化应激，减少自由基对机体的损伤，与此同时它还能够通过干扰嘌呤代谢（GO:0006163、GO:0006198）来直接减少自由基的产生。有研究报道川芎嗪能够直接清除超氧阴离子，并抑制诱导性NO的产生[29]，这一研究验证了我们基于网络药理学的推测。

在冠心病的发生、发展过程中伴随着免疫炎症反应，有研究显示在早发性冠心病患者体内，IL-18、IL-6、IL-10、TNF-α的基因启动子单核苷酸多态性与健康人的存在明显变化，这些基因启动子单核苷酸多态性的差异以及对应血清内细胞因子的浓度变化可以帮助我们解释早发性冠心病患者体内免疫炎症反应的诱发[30]。冠心病并发症如牙周疾病等患者体内，血清炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α、TNF-γ的水平发生了明显改变[31]。速效救心丸网络药理学研究中功能富集分析得到的功能模块3主要包括了与免疫调节和炎症反应相关的代谢通路如GO:0043406、GO:0002757、GO:0002253、GO:0050778等，此外有文献报道藁本内酯能够抑制ERK、JNK和p38[32]，抑制MAPK通路，川芎嗪能够增强Nf-κB抑制剂和抗炎因子IL-10的表达[33]。综上，速效救心丸能够通过发挥免疫调节和改善炎症反应来发挥治疗冠心病的作用。

肾素-血管紧张素系统的调节与内皮功能密切相关，它能够改善高血压患者体内的内皮功能紊乱[34]，肾素-血管紧张素系统的抑制剂如血管紧张素转换酶抑制剂、血管紧张素受体阻断剂在治疗心绞痛方面发挥了有效的作用[35]。功能模块5显示速效救心丸的药效发挥与肾素-血管紧张素系统的调节相关如GO:0001991、GO:0002016、GO:0003081等，速效救心丸通过对肾素-血管紧张素系统的干预来实现对血压等的调节。

综上所述，本研究对速效救心丸中的主要成分进行了吸收能力筛选，共筛得19个原型吸收较好的化合物，对19个化合物及相关蛋白靶点和对应代谢通路进行了整合，并对靶点进行了蛋白互作分析，进而对蛋白互作网络进行了功能富集分析。研究结果显示速效救心丸主要是通过调节脂质代谢和固醇荷尔蒙代谢、氨基酸代谢、免疫调节和炎症反应、肾素-血管紧张素系统调节来改善冠心病患者的氧化应激、能量供应、免疫功能、炎症反应、血压变化。本实验借助网络药理学研究方法从分子网络层面解释了速效救心丸治疗冠心病的潜在药效机制，为速效救心丸的深入药效研究奠定了基础。

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