基于中医理论及临床验证基础上的射干作用机制研究＊

王光函，孙小玲，邹桂欣，尤献民，辛旭阳，刘 晶，李国信＊＊

（1.辽宁省中医药研究院 沈阳 110034；2.辽宁省药品检验检测院 沈阳 110023）

射干，始载于《神农本草经》[1]，其味苦、辛，性寒，微毒，归肺、肝经。具有祛痰利咽、消癖散结、清热解毒、消肿止痛的功效，临床常用于治疗感受风热或痰热壅盛引起的咽喉肿痛、痰涎壅盛，及咳嗽气喘等症，是中医治疗喉痹咽痛之要药。综合分析古典医籍及现代文献[2-6]，确定射干临床上用于治疗发热、恶寒、咳嗽、咯痰、口渴、胸痛或闷、气短等症状，症常见于急性气管-支气管炎、感染后咳嗽（PIC）、慢性阻塞性肺疾病急性加重、支气管哮喘合并感染等气道感染性疾病。

呼吸道合胞病毒（RSV）属副粘液病毒科，肺炎病毒属，是PIC发病及感染的重要感染病原之一，也是医院交叉感染的主要病原。现代医学[7]认为病毒感染导致了气道变应性炎症、气道上皮损伤、气道高反应等。本研究基于射干临床病种筛选试验结果，确定了感染后咳嗽为射干临床治疗病种后，拟采用RSV感染豚鼠咳嗽模型[8]，通过对感染后豚鼠肺组织形态学影响，肺泡灌洗液中白细胞总数及分类计数变化，细胞因子白介素-4（IL-4）、干扰素-γ（IFN-γ）、白三烯-4（LTC4）表达影响，来研究射干提取物对RSV感染后咳嗽模型抗炎作用。

1 材料

1.1 动物与细胞

雄性纯白SPF级豚鼠30只，250-300 g(北京实验动物中心)；呼吸道合胞病毒（武汉病毒研究所赠予）；Hep-2细胞（江苏齐氏生物科技有限公司）。

1.2 药物与仪器

射干提取物（实验室自制）；DMEM高糖培养基、胎牛血清（CORNING）；胰酶(碧云天生物技术有限公司)；枸橼酸（沈阳市试剂一厂）；IFN-γ、IL-4、LTC4 ELISA试剂盒（南京建成生物工程研究所有限公司）；ELX800型酶标仪（BioTek，美国）；石蜡切片机（莱卡）；BX53显微镜（奥林巴斯）。

2 方法

2.1 射干提取物的制备

射干药材1 kg，加70%乙醇提取2次，合并提取液，浓缩至无醇味，用乙醇调整至含醇量为30%，上于D101大孔吸附柱上，用3倍量30%乙醇除杂，继用80%乙醇洗脱，收集洗脱液，干燥至干，即得（每1 g提取物含20.7 g射干药材）。

2.2 Hep-2细胞培养、RSV扩增及组织培养半数感染量（TCID50）的测定

Hep-2细胞使用DMEM培养液（含有10%胎牛血清，100 U·mL-1青霉素，100 g·L-1链霉素），37℃，5%CO2培养箱中常规培养。生长状态良好的细胞每2-3天传代。

Hep-2细胞在培养瓶中长至70-80%融合，吸出培养液，PBS洗2次，加入1 mL无血清培养液，取病毒悬液100µL接种于细胞上，每15 min摇动1次，吸附2 h后倒出病毒液，加入含5%胎牛血清培养液，于第2-3天开始出现细胞病变（CPE），待病变达60-70%时收获病毒，将细胞反复冻融2-3次后，1 000 r·min-1，离心5 min，去除细胞碎片，收集上清分装后，-80℃保存。

取对数生长期Hep-2细胞接种96孔板（1×104cells/well），5%CO2、37℃培养箱培养24 h，细胞贴壁并形成均匀单层时吸弃培养液。梯度稀释病毒至10-3-10-（8病毒液用维持液10倍系列稀释）6个梯度，每孔加100 μL，每列一个稀释度，共6列。其余6列加入培养液，作空白对照。37℃、5%CO2吸附2 h，吸弃病毒液，每孔加维持液100 μL，置培养箱中继续培养，逐日观察病变程度并记录。以最高稀释度不再出现新病变时为终点，结果只记录最后一天病变情况即可。用Reed-Muench公式计算病毒半数细胞感染量(TCID50)。本次实验病毒半数细胞感染量(TCID50）为7×105TCID50。

2.3 RSV感染豚鼠模型的制备及分组

健康豚鼠，常规饲养，一周后开始正式试验。试验分空白组，RSV感染模型组、射干提取物给药组（600 mg·kg-1·日-1），每组10只。

RSV感染模型制备：除空白组外，将其余各组豚鼠放入自制450 mm×450 mm×900 mm熏笼中，每5只一笼，以锯末50 g+10支香烟点燃烟熏，每次30 min，每日1次，连续10天，自由进食吸水，从第5天开始将豚鼠乙醚浅麻后鼻腔滴注100TCID50的RSV悬液100µL（每天滴鼻2次，早晚各1次，空白组给予相同剂量的5%DMEM培养液），连续给药1周。滴入量以体重1µL·g-1计算。给药组自第5天开始给药。

2.4 射干提取物对实验动物镇咳作用的观察

于末次给药45 min时，将动物置于5 L大烧杯中，底部加少量垫料，烧杯口用保鲜膜封，以4.5 mol·L-1枸橼酸溶液雾化吸入激发，每次30 s，观察5 min内豚鼠咳嗽次数。

2.5 肺泡灌洗收集

将豚鼠用2%戊巴比妥（25 mg·kg-1）麻醉后仰卧固定于操作台，打开胸腔，暴露气管和双肺，结扎右主支气管，在隆突上用套管针穿刺至左肺，气管上段剪开插入灌流管，将预温至37℃的生理盐水经气管插管注入肺内，每次灌入2-3 mL，停留30 s，回吸液体，反复3次，灌洗液回收率为70-85%。2 000 r·min-1，4℃离心10 min，上清液分装保存于-20℃冰箱，备用。细胞沉淀用磷酸盐缓冲液（PBS）溶解，在全自动模块式血液体液分析仪上测定白细胞总数、淋巴细胞计数、单核细胞计数及中性粒细胞计数。

2.6 ELISA法测定肺泡灌洗液中IL-4、IFN-γ、LTC4的含量

按照试剂盒要求测定各组豚鼠支气管肺泡灌洗液中IL-4、IFN-γ、LTC4的含量。

2.7 对肺组织形态学影响

结扎右主支气管，采用4%多聚甲醛固定右肺中叶，常规苏木素-伊红(HE)染色，光镜观察肺组织形态结构。

2.8 统计学处理

数据处理采用SPSS18.0统计软件，结果Xˉ±S表示，采用单因素方差分析，P＜0.05表示有显著性差异，P＜0.01有极显著差异。

3 结果

3.1 射干提取物对实验动物镇咳作用的观察

模型组5 min内咳嗽次数显著高于空白组，提示造模成功；而咳嗽潜伏期无显著差异。给药组中，射干提取物对模型动物5 min内咳嗽有显著抑制作用。结果见表1。

表1 射干提取物对枸橼酸引起咳嗽的影响结果(ˉ±S,n=10)

表1 射干提取物对枸橼酸引起咳嗽的影响结果(ˉ±S,n=10)

注：与空白组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05。

图1 射干提取物对RSV感染豚鼠BALF中IL-4、IFN-γ表达的影响

图2 射干提取物对RSV感染豚鼠肺泡灌洗液中LTC4表达的影响

3.2 射干提取物对RSV感染豚鼠BALF中细胞学的改变

模型BALF中白细胞总数、淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞明显高于空白组(P＜0.05)，说明模型建立成功。给药组与模型组相比，BALF中白细胞总数、淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞显著降低(P＜0.05)。见表2。

3.3 射干提取物对RSV感染豚鼠BALF中IL-4、IFN-γ含量及比例的变化

RSV感染豚鼠后，模型组中IL-4水平明显高于空白组（P＜0.05），而IFN-γ水平明显低于空白组（P＜0.05）。给药后，豚鼠BALF中IL-4水平明显降低（P＜0.05），IFN-γ水平明显增高（P＜0.05）结果见图1、表3。

3.4 射干提取物对RSV感染豚鼠BALF中LTC4表达的影响

RSV感染豚鼠后，模型组中LTC4水平明显高于空白组（P＜0.05），给药后LTC4水平明显低于模型组（P＜0.05）。结果见图2、表3。

3.5 射干提取物对RSV感染豚鼠肺组织形态的影响

RSV感染豚鼠后，模型组与空白组相比，可见肺泡壁增厚，有炎性细胞出现，形态变形，并有充血。给药组所有症状均有减轻。

4 讨论

《普济方》数据库管理系统[9]可以对任何一味中药进行跨病种检索，检索结果可得此药复方配伍用于所有病证的构成、各病证配伍此药频数。基于《普济方》数据库古方配伍应用考证结果表明，含射干复方所治疾病以喉痹咽痛、咳嗽、咳喘、咽干、痰热壅盛诸病与2015年版《药典》[10]一部所记功能主治完全吻合。现代文献学研究表明，射干具有抗炎、抗病毒、抗菌、抗氧化等药理作用。结合传统中医药理论研究结果，考虑急性气管-支气管炎（风邪犯肺证）及感染后咳嗽（余热未清证）在炎性表现方面一急一慢，发病方面风热犯肺表现在前期，后期入里化热、余热未清，颇具代表性，故选择此二证为射干临床应用试验病征。前期临床研究结果表明：射干清咳片组与对照组（肺宁片组）治疗后比较虽然没有统计学意义，但从日间、夜间咳嗽、咯痰、痰量评分数值变化可看出，射干清咳片改善明显，证明其治疗感染后咳嗽及急性气管-支气管炎临床疗效确切。

表2 射干提取物对RSV感染豚鼠肺泡灌洗液中细胞学的影响

表3 射干提取物对RSV感染豚鼠BALF中LTC4、IL-4、IFN-γ表达的影响

图3 射干提取物对RSV感染豚鼠肺组织病理切片图

根据临床两个证型的试验结论，结合感染后咳嗽在患病人群中更为常见，患者量较大，患者长期咳嗽不愈，易给患者造成很大心理负担，精神上形成紧张，严重影响患者生活质量，反复检查易造成医疗成本过大，且从疾病角度出发感染后咳嗽在临床上没有更为有效的治疗手段，而急性气管-支气管炎目前临床治疗药品颇为丰富如：抗感解毒冲剂、止咳平喘的川贝批把膏等，所以我们首先选择了感染后咳嗽作为射干作用机制研究的动物模型。

感冒后咳嗽绝大部分由呼吸道病毒感染后引起，又称为感染后咳嗽，目前有关感染后咳嗽的机制知之甚少，缺乏满意的治疗[11]。感染后咳嗽虽然最终大多可以自愈，但过程中可能会严重影响患者的工作和生活，因此，进行病毒感染引起的咳嗽，尤其是感染后咳嗽发病机制的探讨将具有重要的意义。现代医学认为感冒后咳嗽的发病与病毒感染后所产生的变应性炎症、气道上皮损伤、气道神经末梢暴露、神经源性炎症反应及其导致的气道高反应有关[12,13]。

呼吸道变应性炎症产生与Th1/Th2类细胞因子失衡有关，Th1/Th2比例降低是呼吸道变应性炎症发生主要因素，且Th2类细胞因子优势表达是其形成及进展的关键机制[14]。Th1细胞分泌的细胞因子IFN-γ及Th2细胞分泌的细胞因子IL-4与呼吸道变应性炎性反应关系密切，IFN-γ能促进细胞表达MHC-Ⅰ类和MHC-Ⅱ类分子，并抑制Th2细胞的增殖；直接通过气道给予IFN-γ，可抑制抗原激发小鼠特应性气道炎症。白三烯(LTS)是花生四稀酸(Aracliidonic Acid，AA)经5-脂氧酶途径合成代谢产生并具有多种生物活性的脂肪酸,包括LTB4和LTC4等，LTS是引起和加重气道炎症的重要炎症介质,从而导致气道上皮损伤,使咳嗽感受器暴露过多,引起咳嗽敏感性增高[15]。因此对肺泡灌洗液中的IL-4、IFN-γ及LTC4进行测定。

实验结果表明，采用RSV感染豚鼠模型，BALF细胞学及肺组织病理学检查支持气道炎症改变，表明感染后咳嗽模型成功。射干提取物给药组能减少豚鼠咳嗽次数，降低BALF中IL-4含量，升高IFN-γ含量，使IL-4/IFN-γ的比值降低，调节Th1/Th2免疫失衡；并且射干提取物能降低BALF中LTC4水平，显著减少炎性细胞数量，抑制炎性细胞浸润，说明射干提取物可能通过调节Th1/Th2平衡、抑制LTC4表达而抑制炎性介质的释放和聚集，从而减轻气道炎症。

1 王子寿,薛红.神农本草经.成都:四川科学技术出版社,2008:143.

2 李时珍.本草纲目.北京:人民卫生出版社,2004:127-128.

3 兰茂.滇南本草.昆明:云南科技出版社,2004:79.

4 刘艳伟.临床应用射干麻黄汤治疗支气管哮喘效果的随机平行对照研究.中国医药指南,2016,14(7):217-218.

5 何雯,李檬,张瑛.中西医结合治疗小儿急性化脓性扁桃体炎38例.中医儿科杂志,2009,5(1):29-30.

6 石磊,姬志强,康文艺.射干抗病毒注射液的临床应用.中国药房,2012,23(35):3359-3360.

7 You D,Marr N,Saravia J,et al.IL-4Rαon CD4+T cells plays a pathogenic role in respiratory syncytial virus reinfection in mice infected initially as neonates.J Leukoc Biol,2013,93(6):933-942.

8 叶新民,钟南山,刘春丽,等.呼吸道合胞病毒感染对豚鼠咳嗽相关气道功能及其神经递质的影响.中华哮喘杂志,2011,5(3):182-187.

9 梁茂新,黄会生.《普济方》数据库管理系统(软著登字第0002781号).北京:中华人民共和国版权局,1998.

10国家药典委员会.中华人民共和国药典.北京:中国医药科技出版社,2015:285.

11 Yang M,Kumar R K,Foster P S.Interferon-gamma and pulmonary macrophages contribute to the mechanisms underlying prolonged airway hyperresponsiveness.Clin Exp Allergy,2010,40(1):163-173.

12 Estripeaut D,Torres J P,Somers C S,et al.Respiratory syncytial virus persistence in the lungs correlates with airway hyperreactivity in the mouse model.J Infect Dis,2008,198(10):1435-1443.

13 Dicpinigaitis P V,Gayle Y E,Solomon G,et al.Inhibition of coughreflex sensitivity by benzonatate and guaifenesin in acute viral cough.Resp Med,2009,103(6):902-906.

14 Dicpinigaitis PV,Spinner L,Santhyadka G,et al.Effect of tiotropium on cough reflex sensitivity in acute viral cough.Lung,2008,186(6):369-374.

15叶新民,钟南山,刘春丽,等.副流感病毒感染豚鼠咳嗽反射敏感性变化及其神经源性炎症机制探讨.中国病理生理杂志,2011,27(1):1-8.