蛴螬提取物不同途径给药对激光诱导鼠眼CNV模型的影响＊

谭涵宇，李建超,2＊＊，彭 俊，文小娟，周亚莎，彭清华＊＊

（1.湖南中医药大学中医眼科学重点学科 长沙 410208；2.西安市中医医院眼科 西安 710001）

年龄相关性黄斑变性（age-related macular degen⁃eration，AMD），是一种与年龄相关的发生在黄斑区视网膜组织退行性病变，随着年龄的增加逐渐加重，而湿性AMD则是以黄斑部CNV形成为主要病理特征的一种黄斑病变。脉络膜新生血管（choroidal neovascular⁃ization，CNV）是包括湿性AMD在内的多种眼底疾病引起的发生在黄斑部脉络膜的新生血管，可导致反复的出血、渗出以及黄斑水肿，严重危害患者的视力。本研究拟在前期研究的基础上，通过口服、滴眼不同给药途径给药，观察蛴螬提取物对激光诱导CNV鼠眼模型的干预作用。

1 材料

1.1 实验动物

成年BN大鼠（Brown Norway，BN）大鼠32只，雄性，体重180-200 g，实验前排除全身性及眼部疾患，湖南中医药大学实验动物中心清洁级条件下饲养，许可证号：SYXK（湘）2013-0005。动物由北京微通利华实验动物有限公司提供，单位许可证号：SCXK（京）2012-0001，动物来源证号：NO.11400700096597。

1.2 实验药品

蛴螬提取物：由湖南中医药大学药学院提供，分别按药物制剂工艺制成口服、滴眼剂[1]。

1.3 实验试剂

ANG1一抗兔源性抗体：北京博奥森生物技术有限公司，批号：Bs-0800R，规格0.1 mL。VEGF一抗兔源性抗体：武汉博士德生物工程有限公司，批号：BA0407，规格0.1 mL。HTRA1一抗兔源性抗体：北京博奥森生物技术有限公司，批号：Bs-20063R，规格0.2 mL。PV9000通用型免疫组化染色试剂盒：北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：WK151825、K156617J，规格6 mL。DAB浓缩型显色试剂盒：北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：K157716A，规格3 mL。

1.4 主要设备及器材

眼底照相机（日本佳能公司生产）,莱特眼底激光治疗仪（法国Quantel公司生产）,海德堡眼底荧光造影（FFA）仪（德国Heidelberg公司生产）,海德堡光学相干断层扫描仪（德国Heidelberg公司生产）

2 方法

2.1 分组及给药

选用8W龄BN大鼠32只，雄性。随机分成A、B、C、D四组，分别为：A组：健康空白组（8只）；B组：模型组（8只）；C组：口服组（8只）；D组：滴眼组（8只）。C组予以蛴螬提取物口服剂灌胃，1次/日，O.56 g/100 g/天，D组予以蛴螬提取物局部滴眼，4次/日，A、B、D组每日以生理盐水2 mL灌胃，A、B、C各组同时予以玻璃酸钠滴眼液滴眼，4次/日。在造模起分别开始给药，连续2W，各组随机抽取3只动物进行取材检测，其余动物继续给药，直至实验结束取材检测。

2.2 视网膜激光损伤CNV模型的建立

参考杨秀梅，王雨生等提出的方法[2]，并加以改进。B、C、D组大鼠腹腔内注射用0.3%戊巴比妥钠，按每公斤注射45 mg麻醉，用0.5%托比卡胺+0.5%盐酸去氧肾上腺素点眼散瞳。在裂隙灯下，通过前置镜镜用532 nm倍频Nd：YAG激光(光斑直径75 Irm，曝光时间100 ms，能量180 mW)，距视盘约1-1.5PD，在视乳头周围击射视网膜，每眼击射8-10个点，避免直接击射视网膜血管。光凝后以有小气泡产生为准，可伴轻响或少量出血，表示已经击破Bruch’S膜。

2.3 眼底彩色照相、眼底血管造影（FFA）及OCT检查

每只大鼠每只眼激光术前及激光造模术后7、14、21、28d行眼底镜检查、眼底彩色照相、眼底血管造影（FFA）及OCT检查。

2.3.1 眼底彩色照相及荧光素眼底血管造影(FFA)检查

将大鼠麻醉后扩瞳行眼底照相，之后将20%荧光素钠用注射用水稀释成2%荧光素钠，经腹腔注射0.3 mL，海德堡眼底荧光血管造影（FFA）仪记录造影过程。CNV的形成率根据FFA荧光渗漏强度积分来判断。

荧光素渗漏强度判定参考Takehana分级标准[3]，即0级：无荧光渗漏；1级：轻度荧光渗漏；2级：中度荧光渗漏；3级：强荧光渗漏。

荧光渗漏强度积分计算：每个激光斑总积分设为3分，0级计0分；1级计1分；2级计2分；3级计3分。

2.3.2 光学相干断层扫描术（OCT）检查

将大鼠腹腔注射麻醉后，扩瞳行OCT检查，扫描线长度为4 mm，取水平、垂直方向进行扫描，所测图像进行排列、储存。

2.4 取材

实验完毕需要取材的动物6 h后待其体内荧光染料大部分被排出后，麻醉大鼠，立即摘取眼球，12点方位缝线标记，沿角巩膜缘于睫状体扁平部做一小切口，浸泡在4%的多聚甲醛中固定6 h，常规脱水，行全层石蜡包埋，切片。

2.5 视网膜各组织细胞层Ang1、VEGF、HTRA1的检测

促血管生成素1（Ang1）、血管内皮生长因子（VEGF）、丝氨酸蛋白酶（HTRA1）免疫组化检测：采用PV法：是将二抗抗体分子的单价Fab段与酶聚合在一起，与一抗结合后，直接用底物进行显色的方法。

在10×10低倍视野下进行全面观察，寻找视网膜内Ang1、VEGF、HTRA1阳性物质最丰富区域(即“热点”区，染色颜色最深/或染色面积最多)，然后在10×40中倍视野下选择5个热点区，采用图形分析系统定量测量各个指标阳性积分光密度，以此表示它们的含量。

2.6 统计方法

图1 激光光凝术后各组眼底彩色照相组图

3 结果

3.1 眼底彩色照相

激光光凝造模术后各组BN大鼠，于激光光凝术后、1W、2W、3W、4W在全麻下分别行眼底彩色照相。结果如下图1。

如图1所示，各组激光光凝术后，BN大鼠眼底彩色照相可见围绕视乳头周围约1-1.5D可见8-10个灰白色激光斑，边界清晰可见。于激光光凝术后1W，可见各组激光斑弥散，边界不清，部分相互融合。术后2W，各组激光斑色泽变淡，部分激光斑消失，部分激光斑出现色素脱失紊乱。术后3W，各组激光斑色泽进一步变淡，部分激光斑消失，部分激光斑色素脱失紊乱，滴眼组明显可见疤痕形成。术后4W，模型组进一步色素脱失紊乱，口服组及滴眼组均可见色素脱失合并瘢痕形成。

3.2 眼底视网膜血管荧光造影（FFA）情况

激光光凝造模术后各组BN大鼠，于术后、1W、2W、3W、4W在全麻下分别行眼底视网膜血管荧光造影检查，拍照，观察并记录荧光渗漏情况。具体如下图2：

图2 激光光凝术后各组眼底视网膜血管荧光造影结果组图

如图10所见，A1-A4为空白组眼底视网膜血管荧光造影图像，A1示造影早期，部分视网膜静脉仍处于层流期；A2为造影中期，视网膜动静脉高荧光充盈，亦可见脉络膜背景荧光；A3为造影中晚期；A4为造影晚期，视网膜动脉血管荧光开始衰退，脉络膜背景荧光亦减退。B1-B4为模型组激光光凝术后眼底视网膜血管荧光造影图像；B1为激光光凝术后1W，可见较多荧光渗漏点；B2为激光光凝术后2W，可见众多荧光渗漏点呈现强荧光，边界不清；B3为激光光凝术后3W，可见部分荧光渗漏点消退，渗漏较前减退；B4为激光光凝术后4W，可见部分渗漏点消失，出现色素沉着，呈遮蔽性低荧光。C1-C4为口服组激光光凝术后眼底视网膜血管荧光造影图像；C1为激光光凝术后1W，可见荧光渗漏点，渗漏明显；C2为激光光凝术后2W，可见荧光渗漏点，渗漏范围较前减少，渗漏减轻；C3为激光光凝术后3W，可见部分荧光渗漏点消退，渗漏局限；C4为激光光凝术后4W，可见原渗漏点出现荧光着染，呈高荧光。D1-D4为滴眼组激光光凝术后眼底视网膜血管荧光造影图像；D1为激光光凝术后1W，可见呈斑驳样荧光渗漏点，有激光斑周围低荧光环出现；D2为激光光凝术后2W，可见众多荧光渗漏点较前明显减少，渗漏减轻，出现疑似新生血管网，如箭头所示；D3为激光光凝术后3W，可见原荧光渗漏点呈现荧光着染；D4为激光光凝术后4W，可见原疑似新生血管部位并未出现明显荧光渗漏，可见侧支循环建立，背景荧光均匀。

表1 各组造模后不同时期CNV形成率（%）

图3 激光光凝术后各组眼底视网膜光学相干断层扫描结果组图

3.3 蛴螬提取物对CNV的形成率的影响

分别于造模后1W、2W、3W、4W对各组造模大鼠行FFA检查，记录各大鼠模型眼荧光渗漏点数及渗漏强度情况，并根据各自积分计算CNV的形成率，可以通过FFA检查时荧光渗漏强度和面积来判断，荧光渗漏越强，面积越大，也就表示CNV的形成越多。如下表1：

3.4 视网膜光学相干断层扫描（OCT）情况

激光光凝造模术后各组BN大鼠，于术后、1W、2W、3W、4W在全麻下分别行眼底视网膜光学相干断层扫描检查，观察并拍照记录。具体如下图3。

模型眼眼底视网膜光学相干断层扫描仪拍摄的眼底扫描图像，激光斑清晰可见；B1-B4模型组激光光凝术后1-4W后眼底视网膜光学相干断层扫描图像；C1-C4分别为口服组激光光凝术后1-4W后眼底视视网膜光学相干断层扫描图像；D1-D4分别为滴眼组激光光凝术后1-4W后眼底视网膜光学相干断层扫描图像。

如图3所见，A1为空白组正常BN大鼠眼底视网膜光学相干断层扫描图像，A1示视网膜各层结构整齐，清晰可见；A2为BN大鼠激光模型眼眼底视网膜光学相干断层扫描仪拍摄的眼底扫描图像，激光斑清晰可见。B1-B4为模型组激光光凝术后眼底视网膜光学相干断层扫描图像；B1为激光光凝术后1W，可见外核层、外界膜、光感受器细胞层水肿明显，界限不清；B2为激光光凝术后2W，可见视网膜色素上皮/Bruch膜复合体增厚，光感受器层断裂，高反射信号经内核层向前膨出，突破外丛状层，达内核层；B3为激光光凝术后3W，可见视网膜色素上皮/Bruch膜复合体下增厚明显，光感受器层断裂，高反射信号突破外界膜，外核层变薄，亦可见高反射信号，与外丛状层相连，内核层变厚；B4为激光光凝术后4W，可见视网膜色素上皮/Bruch膜复合体下明显增厚的不规则高反射信号向前突破视网膜各层，视网膜各层结构紊乱。C1-C4为口服组激光光凝术后眼底视网膜光学相干断层扫描图像；C1为激光光凝术后1W，可见视网膜色素上皮/Bruch膜复合体、光感受器外节、内外核层、内外丛状层、神经纤维层各层水肿明显，界限欠清；C2为激光光凝术后2W，可见视网膜色素上皮/Bruch膜复合体高信号，明显增厚、外丛状层、内颗粒层增厚；C3为激光光凝术后3W，可见视网膜色素上皮/Bruch膜复合体高信号明显增厚，内颗粒层内出现高反射信号与外丛状层相连；C4为激光光凝术后4W，可见视网膜色素上皮/Bruch膜复合体高信号，略微增厚，内界膜可见，内颗粒层变薄，外丛状层、内颗粒层增厚。D1-D4为滴眼组激光光凝术后眼底视网膜光学相干断层扫描图像；D1为激光光凝术后1W，可见视网膜色素上皮/Bruch膜复合体、光感受器外节、内外核层、内外丛状层、神经纤维层各层水肿明显，界限欠清；D2为激光光凝术后2W，可见视网膜色素上皮/Bruch膜复合体高信号，明显略增厚、外丛状层略增厚；D3为激光光凝术后3W，可见视网膜色素上皮/Bruch膜复合体高信号，视网膜各层结构清晰可辨；D4为激光光凝术后4W，可见视网膜色素上皮/Bruch膜复合体无明显增厚，内颗粒层内出现少许高反射信号，视网膜各层结构清晰。

图4 2W时视网膜组织中Ang1的表达

图5 4W时视网膜组织中Ang1的表达

3.5 BN大鼠视网膜组织免疫组化检测结果

3.5.1 蛴螬提取物对视网膜组织Ang1表达的影响

如图4,5：2W时，正常组视网膜各层细胞浆中Ang1阳性物质表达较少，呈浅黄色，视网膜各层组织细胞结构清晰，排列整齐。模型组内界膜、神经纤维层、内外丛状层、内颗粒层以及光感受器内节细胞浆中Ang1阳性物质表达明显增多，呈棕褐色。口服组和滴眼组各层细胞浆中Ang1阳性物质表达程度明显较模型组减少，呈棕黄色。4W时，四组视网膜各层细胞浆中Ang1阳性物质表达程度相似，其中空白组、口服组、滴眼组与2W时表达程度亦相似，呈浅黄色，视网膜各层组织细胞结构清晰，排列整齐，模型组各层细胞浆中Ang1阳性物质表达程度较2W时明显减少，呈棕黄色。

图6 2W时视网膜组织中HTRA1的表达

图7 4W时视网膜组织中HTRA1的表达

3.5.2 蛴螬提取物对视网膜组织HTRA1表达的影响

如图6,7：2W时，四组视网膜各层细胞浆中HTRA1阳性物质表达程度相似，且都较弱，呈棕褐色。4W时，正常组、口服组和滴眼组视网膜各层细胞浆中HTRA1阳性物质表达较少，呈棕褐色，视网膜各层组织细胞结构清晰，排列整齐。模型组内界膜、神经纤维层、内外丛状层、内颗粒层以及光感受器内节细胞浆中以及玻璃体腔HTRA1阳性物质表达呈强阳性，且较2W时明显增强，呈棕褐色，玻璃体腔亦可见强阳性表达。

3.5.3 蛴螬提取物对视网膜组织VEGF表达的影响

图8 2W时视网膜组织中VEGF的表达

图9 4W时视网膜组织中VEGF的表达

如图8,9：2W时，正常组、口服组和滴眼组视网膜各层细胞浆中VEGF阳性物质表达较少，呈棕褐色，视网膜各层组织细胞结构清晰，排列整齐。模型组内界膜、神经纤维层、内外丛状层、内颗粒层以及光感受器内节细胞浆细胞核中均有VEGF阳性物质高表达，呈强阳性。4W时，正常组、口服组和滴眼组视网膜各层细胞浆中VEGF阳性物质表达基本同2W时，呈棕褐色，视网膜各层组织细胞结构清晰，排列整齐。模型组内界膜、神经纤维层、内外丛状层、内颗粒层以及光感受器内节细胞浆细胞核中均有VEGF阳性物质表达呈强阳性，呈棕褐色，与2W时相比，仍维持高表达。

3.5.4 视网膜各细胞层Ang1、HTRA1、VEGF的光密度值检测结果

2W时，视网膜组织中Ang1、HTRA1、VEGF表达均增强，经蛴螬提取物口服和滴眼后，高表达有所减弱（如下表2）；4W时Ang1表达回归正常水平、HTRA1、VEGF仍维持高表达，经蛴螬提取物口服和滴眼后，Ang1表达无影响，HTRA1、VEGF高表达有所减弱（如下表3）

表2 2W时视网膜各细胞层Ang1、HTRA1、VEGF的光密度值比较(±s)

表2 2W时视网膜各细胞层Ang1、HTRA1、VEGF的光密度值比较(±s)

注：＊表示与空白组比较：＊表示P＞0.05,＊＊表示P＜0.05,＊＊＊表示P＜0.01；△表示与模型组比较：△表示P＞0.05,△△表示P＜0.05,△△△表示P＜0.01；▲表示与口服组比较：▲表示P＞0.05,▲▲表示P＜0.05,▲▲▲表示P＜0.01；

表3 4W时视网膜各细胞层Ang1、HTRA1、VEGF的光密度值比较(±s)

表3 4W时视网膜各细胞层Ang1、HTRA1、VEGF的光密度值比较(±s)

注：＊表示与空白组比较：＊表示P＞0.05,＊＊表示P＜0.05,＊＊＊表示P＜0.01；△表示与模型组比较：△表示P＞0.05,△△表示P＜0.05,△△△表示P＜0.01；▲表示与口服组比较：▲表示P＞0.05,▲▲表示P＜0.05,▲▲▲表示P＜0.01；

具体如下不同时间各组间Ang1、HTRA1、VEGF光密度值检测的示意图所示：（图10）

4 讨论

本课题组前期研究证实：蛴螬提取物对大鼠视网膜的光损伤具有保护作用，蛴螬可以促进HSP79的高表达对视网膜视神经细胞得到有效保护，可减轻组织损伤[3,4]，能够增强视网膜组织中bFGF的表达、抑制GFAP的表达，促进光凝后的视网膜修复[5]，能促进实验性有色兔脉络膜新生血管(CNV)中血管生成素1(An⁃gl)的高表达，减少色素上皮衍生因子(PEDF)的表达，也可以抑制有色家兔脉络膜新生血管(CNV)中的血管内皮生长因子(VEGF)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)表达，从而可以抑制实验性脉络膜新生血管(CNV)的形成[6,7]。

4.1 蛴螬提取物对激光损伤诱导CNV活体模型眼底情况及新生血管生成的影响

图10 组间Ang1、HTRA1、VEGF光密度值检测的箱图

本实验成功应用激光诱导造成湿性AMD的CNV模型，并用蛴螬提取液对其进行干预治疗，通过本实验发现：蛴螬提取液能有效减轻眼底视网膜血管荧光渗漏，促进瘢痕形成，稳定视网膜各层正常的结构及功能，减少激光对视网膜外屏障的损伤，减少新生血管形成，促进眼底视网膜血管在激光损伤后建立有效的侧支循环，进而改善视网膜血液供应及正常的功能。通过对新生血管形成率的统计分析亦证实，蛴螬提取液能有效减少新生血管的生成及病变的严重程度（P＜0.05）。

4.2 蛴螬提取物对激光损伤诱导CNV活体模型Ang1、HTRA1、VEGF表达的影响

促血管生成素1及其受体Tie2是近年来发现的一种除血管内皮生长因子之外的一条新的血管生成信号转导通路，这条新的信号通路在人类生理性血管形成中发挥重要作用，Ang1/Tie2信号通路在肿瘤、创伤、炎症等多种病变中也起一定作用。Angl和受体结合后活化Tie2,Tie2活化的内皮细胞可吸引血管平滑肌细胞、周细胞等包围、支持内皮细胞形成完整的血管壁，从而促进血管生成[8]。雷润佳[9]通过激光诱导小鼠CNV模型，CNV在光凝后14d达到高峰。存在Ang1与HIF-1共表达区域，提示在CNV生成中可能起重要作用；在此基础上，体外实验结果提示缺氧条件下人RPE细胞表达Ang1上调，与HIF-1α存在时相关系，Ang2无明显变化；抑制HIF-1α后，Ang1表达随之降低。

血管内皮生长因子(VEGF)是内皮细胞异性促有丝分裂原，通过特异性受体介导作用于血管内皮细胞，对血管内皮细胞发挥促分化和趋化作用，并促进内皮细胞增殖和迁移，同时增加血管通透性，以利于新生血管和基质细胞生长。血管内皮生长因子在促进血管新生、维持血管形态及完整性具有重要意义。正常情况下，视网膜的周细胞、视网膜色素上皮细胞和内皮细胞均可产生较低水平VEGF。众多研究表明VEGF的高表达与脉络膜新生血管形成有密切关联，是导致脉络膜新生血管形成的主要因素之一。抗VEGF药物可减轻VEGF升高导致的血管通透性增加，减轻组织水肿，同时也可减轻炎性反应，减少新生血管的生成。因此VEGF被认为是治疗脉络膜与视网膜新生血管最重要的靶点。目前，已有多种抗新生血管药物应用于临床，如贝伐单抗、雷珠单抗、康柏西普、呱加他尼钠及VEGF诱饵受体等，并已取得可观的临床效果[10]。

HTRAl是第一个被发现的人HtrA丝氨酸蛋白酶家族成员，是一种分泌蛋白，与细胞外基质的降解作用有关。HTRA1基因启动因子区域的多态性与湿性年龄相关性黄斑病变（AMD)具有显著的关联性[11,12]。纯合型LOC387715/HTRA1基因多态性使AMD的发病风险增加7.6倍[13]。在AMD患者的眼球切片免疫组织化学研究中发现，HTRA1在Bruch膜和内界膜中均有表达，而在其他层次未见明显表达，提示该蛋白可能参与了破坏Bruch膜完整性的反应过程。随着HTRA1的过高表达，它可能在Bruch膜的结构重构以及进一步的脉络膜新生血管形成或视网膜色素上皮细胞萎缩过程中发挥作用，并且rsl 1200638与AMD的两种类型(地图状萎缩和脉络膜新生血管性AMD)具有几乎一致的显著相关性。HTRA1基因与CNV密切相关，高水平的HTRAl蛋白表达影响了Bruch膜的完整性，利于CNV的生长[14]。Richardson AJ等[15]研究发现表明在HTRA1基因中tagSNP、rs3793917和SN Prs11200638之间的基因间区域是解释与AMD显著关联的最可能位点。蒋晶晶[16]用携带人HTRAl基因的慢病毒感染体外培养的人RPE细胞，结果发现过表达HTRAI基因能抑制人视网膜色素上皮细胞的增殖及迁移，推测THRAl基因可能通过影响RPE细胞功能参与AMD的进程。

本实验结果表明：2W时，激光诱导湿性AMD模型眼视网膜组织中Ang1、VEGF高表达，而HTRA1则未见明显高表达；4W时，激光诱导湿性AMD模型眼视网膜组织中HTRA1出现高表达、VEGF维持了高表达，而Ang1表达趋于正常。蛴螬提取物对激光诱导湿性AMD模型眼视网膜组织中不同时期Ang1、HTRA1、VEGF的高表达具有明显抑制作用。进而表明蛴螬提取物对激光诱导的湿性AMD模型眼CNV形成的早期及晚期均有抑制作用。

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